安 宇 王 穎,2WG ,2 易華西 - 張東杰ZHG -

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2. 國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000)

細(xì)菌素是某些細(xì)菌代謝時(shí)，經(jīng)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的多肽或前體多肽，抑菌活性較突出[1-2]。對(duì)同種近緣菌株呈狹窄活性抑制譜，常附著于敏感細(xì)胞特異性結(jié)合位點(diǎn)，通過抑制細(xì)胞生長代謝所必需的組分合成，致使敏感細(xì)胞死亡，從而起到抑菌效果[3-4]。現(xiàn)階段，以乳酸鏈球菌素(Nisin)為代表天然防腐劑克服了生產(chǎn)上的諸多不足，以易消化和降解，使用無蓄積性毒害作用、零殘留、遺傳穩(wěn)定性良好等特點(diǎn)，逐步成為研究者和消費(fèi)者的關(guān)注熱點(diǎn)[5-6]。

在微生物發(fā)酵工藝中，菌種的培養(yǎng)基組分是影響其菌種生長代謝和增殖的決定性因素[7-8]。對(duì)發(fā)酵條件的控制直接有利于開發(fā)菌株的發(fā)酵潛力，因此確定合適培養(yǎng)基配比和適合菌種生長增殖的發(fā)酵條件就顯得重要[9]。除受菌株自身遺傳學(xué)特質(zhì)影響外，細(xì)菌素產(chǎn)量不僅對(duì)生長環(huán)境有限制和要求，某些類細(xì)菌素還需外圍干預(yù)和誘導(dǎo)才能更好地分泌和蓄積[10]。其中生長環(huán)境多從培養(yǎng)基中氮源和碳源等功能成分的比例，或培養(yǎng)環(huán)境中各條件因素的均衡或特定配比考究，來完成目標(biāo)物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放。目前對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究，主要集中在對(duì)培養(yǎng)環(huán)境(培養(yǎng)溫度、時(shí)間、pH等)的優(yōu)化[11-13]，以及對(duì)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分中單一成分來源的優(yōu)化研究[14-15]，而對(duì)培養(yǎng)基中多種營養(yǎng)成分的最優(yōu)篩選及與刺激因子協(xié)同作用效果的研究仍較少報(bào)道。研究以課題組前期通過復(fù)合誘變法(微波—常壓室溫等離子體—亞硝基胍誘變)獲得的在仍保持降膽固醇能力的基礎(chǔ)上，可產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌M1-NTG300為研究對(duì)象，擬通過對(duì)培養(yǎng)基中多種營養(yǎng)成分及刺激因子的篩選與組合，優(yōu)化其發(fā)酵條件，以便提高細(xì)菌素的產(chǎn)量，為其應(yīng)用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌M1-NTG300：實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)分離保藏菌種；

指示菌：金黃色葡萄球菌、熒光假單胞桿菌，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品微生物實(shí)驗(yàn)室；

MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白胨：生化試劑(BR)，青島海博生物技術(shù)有限公司；

葡萄糖、吐溫80、氯化鎂：分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱：DRP-9082型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP-250型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：722型，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

超凈工作臺(tái)：BCN-1360型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-75KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

臺(tái)式多管架離心機(jī)：TD5A型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備 對(duì)出發(fā)菌株活化24 h以后，用2%的接菌濃度(108～109CFU/mL)接入MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后(37 ℃)，離心(8 000 r/min，5 min)，除去菌體，用NaOH(5 mol/L)調(diào)上清液pH至 6.0～6.5，過濾膜(0.22 μm)，得到無細(xì)胞發(fā)酵上清液。

1.3.2 抑菌活性的測定 加熱指示菌固體培養(yǎng)基，待其融化冷卻至45～50 ℃后倒板，平板凝固后將牛津杯平均分布于內(nèi)。加熱指示菌半固體培養(yǎng)基使其融化，冷卻至45～50 ℃。稀釋指示菌液濃度至10-2，在600 nm下檢測發(fā)酵液的OD值。用移液槍吸取50 μL指示菌液接入指示菌半固體培養(yǎng)基中后倒板。在平板完全凝固時(shí)拔出牛津杯，并于孔中添加50 μL發(fā)酵液。在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察是否有抑菌圈生成[16-17]。游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，采用Nisin效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算效價(jià)[18]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 碳源濃度的影響：選擇葡萄糖作為培養(yǎng)基中的碳源，濃度分別為2%～4%等差分配，37 ℃培養(yǎng)24 h，以原MRS液體培養(yǎng)基平行對(duì)照。在葡萄糖濃度不同的MRS液體培養(yǎng)基中，接種M1-NTG300測抑菌性[19]。

(2) 氮源濃度的影響：選擇蛋白胨作為培養(yǎng)基中的氮源，濃度分別為2%～4%等差分配，37 ℃培養(yǎng)24 h，以原MRS液體培養(yǎng)基平行對(duì)照。在蛋白胨濃度不同的MRS液體培養(yǎng)基中，接種M1-NTG300測抑菌性。

(3) 不同濃度刺激因子的影響：選擇吐溫80作為培養(yǎng)基中的刺激因子，濃度分別為0.20%～0.40%等差分配，37 ℃培養(yǎng)24 h，以原MRS液體培養(yǎng)基平行對(duì)照。在吐溫80添加量不同的MRS液體培養(yǎng)基中，接種M1-NTG300測抑菌性。

(4) 金屬離子濃度的影響：選擇不同濃度MgCl2作為培養(yǎng)基中的金屬離子，濃度分別為0.05%～0.25%等差分配，37 ℃培養(yǎng)24 h，以原MRS液體培養(yǎng)基平行對(duì)照，接種M1-NTG300測抑菌性。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，通過Box-Behnken進(jìn)行響應(yīng)面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源濃度對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 如圖1所示，當(dāng)葡萄糖濃度不同時(shí)，細(xì)菌素分泌量及抑菌活性的增加在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，而隨葡萄糖濃度的繼續(xù)增大，細(xì)菌素效價(jià)和抑菌效果反而降低，分析原因可能是適宜濃度葡萄糖有利于細(xì)菌代謝繁殖，而外界葡萄糖濃度過高時(shí)滲透壓升高，導(dǎo)致細(xì)菌滲透作用失水而發(fā)生質(zhì)壁分離影響其生長[20]。綜上，優(yōu)選3.5%作為最佳葡萄糖濃度。

2.1.2 氮源濃度對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 如圖2所示，細(xì)菌素效價(jià)及抑菌活性隨蛋白胨濃度的增加一定范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。蛋白胨濃度為3.0%時(shí)，植物乳桿菌素效價(jià)和抑菌活性均較好。蛋白胨濃度大于3.0%時(shí)，細(xì)菌素隨濃度增加小幅度下降。這可能是由于培養(yǎng)基中蛋白胨濃度或高，導(dǎo)致膜內(nèi)外滲透壓不同，細(xì)胞膜內(nèi)水分進(jìn)入營養(yǎng)液，導(dǎo)致細(xì)胞生長受影響[21]。綜上，最佳蛋白胨濃度為3.0%。

圖2 氮源對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響

2.1.3 刺激因子添加量對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 如圖3所示，細(xì)菌素效價(jià)及抑菌活性與吐溫80濃度在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，吐溫80不僅能提高細(xì)胞膜的通透性，減少表面張力，還能促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)透壁代謝，增多的營養(yǎng)類物質(zhì)對(duì)產(chǎn)生細(xì)菌素具有正向促進(jìn)作用[22]。吐溫80濃度為0.30%時(shí)細(xì)菌素的產(chǎn)量最高，抑菌效果最顯著。之后，細(xì)菌素效價(jià)和抑菌性隨吐溫80濃度增大反而迅速減小，吐溫80濃度過高會(huì)造成細(xì)菌生長停滯甚至死亡[23]。綜上，選擇濃度為0.30%的吐溫80為最佳刺激因子。

圖3 刺激因子對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響

2.1.4 金屬離子濃度對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 由圖4可知，隨著MgCl2濃度的增加，植物乳桿菌素效價(jià)和抑菌活性呈先上升而后下降的趨勢(shì)。當(dāng)MgCl2添加量高達(dá)0.20% 時(shí)，細(xì)菌素的抑菌效果最佳，且效價(jià)最大。這可能是由于MgCl2對(duì)細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要作用[24-25]，但MgCl2濃度過高會(huì)造成體系滲透壓增大，而細(xì)菌調(diào)節(jié)體內(nèi)Mg2+能力有限[26]。因此0.20% MgCl2可以作為優(yōu)產(chǎn)細(xì)菌素的最佳濃度。

圖4 金屬離子對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以植物乳桿菌素的效價(jià)為響應(yīng)值，對(duì)葡萄糖濃度、蛋白胨濃度、吐溫80添加量和MgCl2濃度設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析 采用Design-Expert 8.0.5.0軟件中的Box-Behnken程序進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到的二次回歸模型為：

表2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)結(jié)果?

Y=0.58A+1.28B+0.46C-0.18D+1.02AB+0.82AC-1.72AD-1.50BC+3.32BD-3.10CD-2.47A2-3.80B2-2.62C2-4.48D2。

(1)

由表3可知，回歸模型顯著(P<0.05)，表明與實(shí)際情況擬合度好；模型的失擬項(xiàng)為0.598 8>0.05，表明在P=0.05水平上不顯著，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起，對(duì)試驗(yàn)干擾小，證明試驗(yàn)的可靠性。預(yù)測值和真實(shí)值之間有較好的相關(guān)性，試驗(yàn)誤差小，因此可用該方程對(duì)植物乳桿菌素效價(jià)進(jìn)行預(yù)測。由F值可知，各因素對(duì)植物乳桿菌素效價(jià)影響大小先后順序?yàn)椋築(蛋白胨濃度)>A(葡萄糖濃度)>C(吐溫80濃度)>D(MgCl2濃度)。

2.2.3 響應(yīng)曲面交互作用分析 由圖5可知，效價(jià)隨因素值增大而升高，當(dāng)達(dá)到曲面中心點(diǎn)極值時(shí)開始下降，蛋白胨濃度(B)和MgCl2濃度(D)及吐溫80濃度(C)和MgCl2濃度(D)兩量間交互作用所得到的響應(yīng)面圖曲面較陡峭，且等高線皆為橢圓形，表明BD、CD交互作用顯著，與表3方差分析中顯著性試驗(yàn)結(jié)果一致。表3方差分析表明其他4組交互作用均不顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)植物乳桿菌素效價(jià)影響的響應(yīng)面及等高線圖

2.2.4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 結(jié)合回歸模型和響應(yīng)面圖分析得出植物乳桿菌素的最佳培養(yǎng)條件是：葡萄糖濃度為3.476%，蛋白胨濃度為3.391%，吐溫80添加量為0.347%，MgCl2濃度為0.198%?？紤]實(shí)際試驗(yàn)條件，確定最終植物乳桿菌素的培養(yǎng)條件葡萄糖濃度為3.5%，蛋白胨濃度為3.5%，吐溫80添加量為0.35%，MgCl2濃度為0.20%，在此條件下經(jīng)過5次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后得出，植物乳桿菌素的效價(jià)為(1 269.4±2.57) IU/mL。效價(jià)預(yù)測值與理論值1 270.5 IU/mL極接近，說明響應(yīng)面分析所得的回歸模型是可靠的。

3 結(jié)論

培養(yǎng)基組分單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果顯示：植物乳桿菌M1-NTG300產(chǎn)細(xì)菌素的MRS培養(yǎng)基最佳組分為葡萄糖濃度3.5%、蛋白胨濃度3.0%、吐溫80濃度0.30%、氯化鎂濃度0.20%。在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，經(jīng)驗(yàn)證，該模型合理可靠。通過模型分析并結(jié)合實(shí)際值進(jìn)行修正后，得到的最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖濃度3.5%、蛋白胨濃度3.5%、吐溫80濃度0.35%、氯化鎂濃度0.20%，此條件下植物乳桿菌M1-NTG300所產(chǎn)細(xì)菌素的效價(jià)為1 269.4 IU/mL，與未進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化前所產(chǎn)細(xì)菌素的效價(jià)(1 082.5 IU/mL)相比，提高了19.8%。有關(guān)研究[27-30]表明，細(xì)菌素的產(chǎn)量與細(xì)菌培養(yǎng)條件有關(guān)外，還受某些干預(yù)細(xì)菌素分析的誘導(dǎo)調(diào)控因素影響，因此后續(xù)試驗(yàn)將考慮從氨基酸誘導(dǎo)、最小初始接菌濃度及信號(hào)分子(肽類物質(zhì)或者蛋白類物質(zhì))等方面對(duì)進(jìn)行深入研究，從而更全面探析影響植物乳桿菌M1-NTG300產(chǎn)細(xì)菌素的因素。