梁 鋒 徐文泱 - 趙紅清 - 王 凱 劉漾倫 -

(1. 湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410017；2. 食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410017)

偶氮型工業(yè)染料的提取溶劑多為無(wú)機(jī)酸、甲醇、丙酮、乙腈、乙酸乙酯、水[3-4]等，試劑的種類應(yīng)根據(jù)目標(biāo)物的極性進(jìn)行選擇；檢測(cè)采用的凈化手段有液液萃取[5]、固相萃取[6]、基質(zhì)分散固相萃取[7]和凝膠滲透色譜技術(shù)[8]等。液相色譜及液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法以其高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)，常被用來(lái)篩查和確證食品中的痕量工業(yè)染料[9-11]。Lim等[12]以C18SPE小柱對(duì)食品中的二甲基黃和二乙基黃凈化，結(jié)合液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀確證，定量限分別達(dá)0.09，0.14 mg/kg。Yoshioka等[13]采用聚酰胺粉小柱實(shí)現(xiàn)飲料、糖漿和糖果基質(zhì)樣品的凈化，光電二極管陣列液相色譜儀檢測(cè)水溶性色素紅2G，其定量限可達(dá)0.1 mg/kg。Minioti等[14]以水為溶劑，稀釋或超聲提取飲料、果醬、糖果中包括紅2G在內(nèi)的13種合成染料，重點(diǎn)優(yōu)化了流動(dòng)相的選擇和洗脫程序。目前尚未建立這3種工業(yè)染料在食品中同時(shí)測(cè)定的檢驗(yàn)方法，為了加強(qiáng)對(duì)這種在食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)活動(dòng)中可能出現(xiàn)的非法添加行為的監(jiān)管，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局在2019年公開征集食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法需求后，根據(jù)重要緊急以及科學(xué)可行的原則進(jìn)行篩選，并組織專家評(píng)審將調(diào)味品、豆制品和肉制品中二甲基黃、二乙基黃和紅2G的檢測(cè)方法列為目前急需建立的食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法，以加強(qiáng)對(duì)食品安全案件調(diào)查、食品安全事故處置等工作的技術(shù)支撐，提高監(jiān)管效能。試驗(yàn)擬建立3種工業(yè)染料在食品中的同時(shí)測(cè)定方法，采用液相色譜法定量，液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀進(jìn)行定性確證，旨在為監(jiān)測(cè)監(jiān)督此類物質(zhì)的非法使用提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：1260 Infinity型，美國(guó)Agilent公司；

液相色譜—質(zhì)譜儀：Q Exactive Focus/U3000 Rs UPLC型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司；

分析天平：CP214型，奧豪斯儀器(上海)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-2000A型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 材料與試劑

水：GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水；

鹽酸、無(wú)水硫酸鈉、乙酸銨：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；

紅2G、二甲基黃、二乙基黃標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.9%，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；

HLB固相萃取小柱：6 mL，300 mg，美國(guó)Waters公司。

1.3 樣品前處理

稱取5 g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 鹽酸酸化的50%乙腈—水溶液，渦旋混勻，4 500 r/min 離心2 min，重復(fù)提取一次后合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，以50%乙腈—水溶液定容至2 mL，上清液待凈化。

HLB固相萃取小柱用3 mL乙腈活化，加入待凈化液，棄去流出液；加入3 mL乙腈，棄去流出液，加入4 mL 10%氨水—甲醇，收集流出液。將流出液于50 ℃下氮吹至干，用50%乙腈—水溶液定容至1 mL，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜分析。如實(shí)際樣品中有檢出，通過(guò)保留時(shí)間及DAD光譜圖不能準(zhǔn)確定性，可通過(guò)高效液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行確證。聚酰胺粉小柱、DMY固相萃取柱、PSA小柱的方法分別參照文獻(xiàn)[15-16]。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

(1) 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取紅2G、二甲基黃、二乙基黃各0.010 0 g于100 mL容量瓶中，用50%乙腈—水溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，0～4 ℃冷藏保存，有效期6個(gè)月。

(2) 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確吸取紅2G、二甲基黃、二乙基黃標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各5 mL于同一25 mL容量瓶中，用50%乙腈—水溶液稀釋至刻度，搖勻。0～4 ℃冷藏保存，有效期1個(gè)月。

(3) 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取不同體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用50%乙腈—水溶液稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，臨用新制。

1.5 色譜條件

色譜柱：C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.02 mol/L乙酸銨，B為乙腈，洗脫梯度程序見表1；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：二甲基黃410 nm，二乙基黃418 nm，酸性紅507 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 色譜柱梯度洗脫程序

1.6 液相色譜—質(zhì)譜條件

1.6.1 二甲基黃及二乙基黃液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定

(1) 液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C1850 mm×2.1 mm，1.7 μm，進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A為含0.1%甲酸+0.05 mol/L 乙酸銨—水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，按表2進(jìn)行梯度洗脫。

表2 二甲基黃及二乙基黃液梯度洗脫程序

(2) 質(zhì)譜條件：離子化方式為電噴霧電離；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓3 000 V；傳輸毛細(xì)管溫度500 ℃；MRM模式下參數(shù)設(shè)置見表3。

表3 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下二甲基黃、二乙基黃的質(zhì)譜參數(shù)

1.6.2 紅2G液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定

(1) 液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C1850 mm×2.1 mm，1.7 μm；進(jìn)樣量5 μL；柱溫40 ℃；流速0.2 mL/min；流動(dòng)相A為含0.05 mol/L乙酸銨—水溶液，流動(dòng)相D為乙腈，按表4進(jìn)行梯度洗脫。

表4 紅2G的梯度洗脫程序

(2) 質(zhì)譜條件：離子化方式為電噴霧電離；負(fù)離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；噴霧電壓2 500 V；傳輸毛細(xì)管溫度500 ℃；質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置見表5。

表5 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下紅2G的質(zhì)譜參數(shù)

將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按液相色譜參考條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定相應(yīng)的色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按前述儀器條件測(cè)定樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，記錄樣品和混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中目標(biāo)物的保留時(shí)間。若樣品中檢出與混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液中待測(cè)物保留時(shí)間一致的色譜峰(變化范圍在±2.5%內(nèi))，且其定性離子與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液中相應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度相比偏差不超過(guò)表6規(guī)定的范圍，則可以確定樣品中檢出相應(yīng)的待測(cè)物。

表6 定性確定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件優(yōu)化

二甲基黃、二乙基黃呈堿性帶正電荷，以0.1%甲酸—水溶液和乙腈作為流動(dòng)相峰形和信號(hào)靈敏度較好，紅2G可電離出H+，用乙酸銨或甲酸銨—水溶液作為流動(dòng)相出峰峰形較好。采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)使用同一流動(dòng)相時(shí)，3個(gè)化合物不能同時(shí)達(dá)到峰形良好的狀態(tài)。而液相色譜法采用0.02 mol/L乙酸銨和乙腈為流動(dòng)相時(shí)，峰形良好，無(wú)雜質(zhì)峰干擾，3個(gè)峰得到較好的分

離。因此選用液相色譜法作為定量方法，當(dāng)液相色譜法無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確定性時(shí)，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)其進(jìn)行確證。由圖1～3可知，流動(dòng)相中二甲基黃、二乙基黃、紅2G分別在410，418，507 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，因此分別選擇這3個(gè)波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1. 紅2G 2. 二甲基黃 3. 二乙基黃

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 溶劑的選擇 配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液澄清透明，靜置24 h 后無(wú)沉淀物或懸浮物，說(shuō)明所選的溶劑對(duì)這3種色素的溶解性較好。

2.2.2 凈化柱的選擇 由圖4可知，聚酰胺粉對(duì)二甲基黃和二乙基黃的回收率不高，可能是由于pH為3～4時(shí)，其對(duì)色素的吸附效果最好；DMY的固相萃取小柱更適合于二甲基黃和二乙基黃的檢測(cè)，對(duì)于紅2G的凈化效果不理想；PSA固相萃取柱的平均回收率不高。HLB是一種親脂性與親水性填料混合的固相萃取柱[17-18]，其準(zhǔn)確性較其他3種凈化方式高。因此，在固相萃取柱的選擇方面采用具有親水性和疏水性的HLB固相萃取柱。

圖2 紅2G標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流色譜圖和提取離子色譜圖

圖3 二甲基黃和二乙基黃的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流色譜圖和提取離子色譜圖

圖4 4種凈化方式對(duì)不同食品類別中3種偶氮性化合物回收率的影響

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的測(cè)定

基質(zhì)效應(yīng)是以液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的痕量樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)考慮的因素[19]。試驗(yàn)方法的研究對(duì)象為調(diào)味品、肉制品和豆制品，其蛋白質(zhì)和脂肪易影響凈化結(jié)果。選取3種不同的基質(zhì)，其斜率比為80%～115%。因此可不考慮基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.4 線性范圍和檢出限

試驗(yàn)表明，二甲基黃的線性回歸方程為Y=1.36×105x-7.03×103，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8；二乙基黃的線性回歸方程為Y=1.49×105x-8.66×103，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7；紅2G的線性回歸方程為Y=2.07×105x+9.18×103，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，表明在5.0～100.0 μg/mL內(nèi)呈線性關(guān)系，符合定量要求。當(dāng)稱樣量為5 g時(shí)，紅2G的檢出限為0.5 mg/kg，二甲基黃、二乙基黃的檢出限均為0.1 mg/kg。由此可知，采用此方法的檢出限低，3種偶氮型化合物的線性良好。

2.5 回收率和精密度

由表7可知，調(diào)制品中的回收率為81.2%～90.5%，肉制品中的回收率為80.7%～91.8%，豆制品中的回收率為81.4%～85.2%。試驗(yàn)方法對(duì)加標(biāo)食品中的3種偶氮型化合物檢測(cè)具有理想的回收率和精密度。

表7 辣椒醬中紅2G、二甲基黃、二乙基黃的回收率和精密度

3 結(jié)論

建立了同時(shí)測(cè)定調(diào)味品、肉制品及豆制品中紅2G、二甲基黃和二乙基黃等偶氮性工業(yè)染料的液相色譜法和LC-MS/MS方法。結(jié)果表明，試驗(yàn)方法在0.1～10.0 μg/mL 內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，在添加濃度為0.000 5，0.001 0，0.005 0 mg/kg時(shí)的回收率為80.7%～91.8%，具有較為理想的回收率和精密度，滿足新方法確認(rèn)的技術(shù)參數(shù)要求，為進(jìn)一步強(qiáng)化檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)對(duì)食品安全監(jiān)管的支撐作用提供了方法參考。后續(xù)可進(jìn)一步增加偶氮型工業(yè)染料的數(shù)量，擴(kuò)展研究的食品基質(zhì)，建立多種工業(yè)染料的同時(shí)測(cè)定方法。