白雪菲，金 剛，劉 思，馬 雯，張 眾，王卉青，張軍翔

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)葡萄酒學(xué)院，葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心，寧夏葡萄與葡萄酒工程技術(shù)中心，寧夏 銀川 750021）

葡萄酒的釀造主要包括2 個(gè)不同的發(fā)酵過(guò)程：由酵母菌完成的乙醇發(fā)酵和由乳酸菌完成的蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵（malolactic fermentation，MLF）[1-2]。MLF通過(guò)乳酸菌將L-蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-乳酸，提高了葡萄酒的微生物穩(wěn)定性，并且通過(guò)產(chǎn)生多種酶類水解揮發(fā)性物質(zhì)前體釋放出多種不同的香氣物質(zhì)，從而改善葡萄酒的香氣結(jié)構(gòu)，提高葡萄酒的品質(zhì)[3-6]。

目前，生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的MLF菌種為酒酒球菌（Oenococcus oeni），它具有優(yōu)良的發(fā)酵特性和應(yīng)對(duì)多種葡萄酒逆境脅迫的能力，但由于世界范圍內(nèi)少數(shù)幾家商業(yè)酒酒球菌的廣泛使用，使得本土微生物資源受到威脅，也帶來(lái)葡萄酒的同質(zhì)化等問(wèn)題。特別是我國(guó)西部葡萄酒產(chǎn)區(qū)在11月份后正值MLF進(jìn)行時(shí)氣溫迅速下降，在一些控溫條件差的酒廠，利用傳統(tǒng)商業(yè)乳酸菌進(jìn)行MLF存在困難。寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄種植區(qū)域面積廣大，風(fēng)土差異明顯，有較豐富的釀酒微生物資源，開(kāi)發(fā)利用本土釀酒微生物資源，不但可以突出葡萄酒的“風(fēng)土”特征，而且可以逐步篩選出適合當(dāng)?shù)丨h(huán)境的釀酒微生物。

目前，關(guān)于蘋(píng)果酸-乳酸細(xì)菌篩選的研究多集中于酒酒球菌[7-8]，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)和酒酒球菌一樣，乳桿菌（Lactobacillus）屬中的希氏乳桿菌（L.hilgardii）同樣具有啟動(dòng)和完成MLF的能力，并產(chǎn)生與酒酒球菌不同的香氣物質(zhì)[9]。然而，我國(guó)關(guān)于希氏乳桿菌的篩選及其對(duì)葡萄酒MLF影響的研究卻鮮有報(bào)道。近年來(lái)，研究者對(duì)能在低溫條件下完成MLF菌株的篩選越來(lái)越感興趣[10-13]。Olguín等[14]對(duì)從Patagonian紅葡萄酒中分離出的2 株酒酒球菌UNQOe4和UNQOe19分別進(jìn)行低溫MLF，結(jié)果表明這2 株酒酒球菌均能在18 ℃和21 ℃完成MLF，且完成這一過(guò)程的菌株可能屬于嗜冷菌群。目前，低溫發(fā)酵通常應(yīng)用于乙醇發(fā)酵，并以此改善葡萄酒的品質(zhì)，但關(guān)于低溫條件下進(jìn)行MLF對(duì)葡萄酒香氣的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以從寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)篩選出的1 株希氏乳桿菌Q19為研究對(duì)象，探究其在不同溫度條件下的發(fā)酵性能及其對(duì)葡萄酒香氣成分的影響，以期為希氏乳桿菌在低溫發(fā)酵中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持與參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

希氏乳桿菌Q19分離自寧夏賀蘭山東麓青銅峽產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒自然MLF過(guò)程中。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸粉8.0 g/L，酵母浸粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，K2HPO32.0 g/L，檸檬酸氫二銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，吐溫80 1.0 mL/L，加80%蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 4.8，121 ℃滅菌20 min后，再加入20%蘋(píng)果汁。

供試酒樣：選用2017年寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)乙醇發(fā)酵結(jié)束、未啟動(dòng)MLF的赤霞珠干紅葡萄酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)14.6%，殘?zhí)?.04 g/L，pH 3.75）。

蘋(píng)果酸試劑盒（L-Malic Acid Enology Enzymatic kit）乙酸、檸檬酸、L-乳酸、總酸、總糖試劑盒（Enology Enzymatic kit） 西班牙BioSystems SA公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890 B氣相色譜-7000D質(zhì)譜儀 美國(guó)Agilent公司；GL323l-1SCN電子天平、PB-10精密pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；311 CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SHP-150B型生化培養(yǎng)箱 常州諾基儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種的準(zhǔn)備

將保藏菌劃線于MRS固體培養(yǎng)基，在28 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)3 d。在MRS固體培養(yǎng)基上挑取菌落特征明顯的單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基，于28 ℃、厭氧條件下培養(yǎng)72 h制成種子液。

1.3.2 MLF

將乙醇發(fā)酵結(jié)束后的赤霞珠葡萄酒酒樣經(jīng)0.2 μm孔徑的過(guò)濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，將活化菌液以1%（V/V）接種量接種于250 mL葡萄酒中，未進(jìn)行MLF（添加60 mg/L SO2且不接種菌液）相同容積的葡萄酒作為對(duì)照組，均做2 個(gè)重復(fù)。滿瓶密封分別放置于10、15、20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每4 d取樣。

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定葡萄酒中的菌落總數(shù)；用蘋(píng)果酸試劑盒檢測(cè)L-蘋(píng)果酸含量；L-蘋(píng)果酸含量趨于穩(wěn)定后用氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定各酒樣的香氣成分；乙酸、檸檬酸、L-乳酸、總酸、總糖在MLF前后用總糖試劑盒試劑盒檢測(cè)。

1.3.4 香氣成分的測(cè)定

采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜儀對(duì)香氣物質(zhì)進(jìn)行提取分析。將萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS在250 ℃條件下老化10 min。取5.0 mL酒樣于頂空瓶中，加入1.5 g NaCl及10.0 μL內(nèi)標(biāo)物4-甲基-2-戊醇，45 ℃保溫5 min后將萃取頭插入頂空瓶，45 ℃萃取35 min。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：進(jìn)樣溫度230 ℃，解吸8 min，不分流進(jìn)樣，載氣為高純氦氣；流速1 mL/min；程序升溫：初始溫度40 ℃，恒溫5 min，然后以3 ℃/min升至130 ℃，以2 ℃/min升至144 ℃，以5 ℃/min升至240 ℃，保持10 min。傳輸線溫度和離子源溫度分別為240 ℃和230 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍40～300 u。

定性：香氣成分利用質(zhì)譜全離子掃描模式下的總離子流圖譜，依據(jù)色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜信息、NIST 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)比對(duì)結(jié)果以及參考相關(guān)文獻(xiàn)相結(jié)合的方法進(jìn)行定性分析。

定量：采用內(nèi)標(biāo)法，各香氣成分質(zhì)量濃度計(jì)算公式如下：

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用Duncan檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05，差異顯著），對(duì)發(fā)酵酒樣的香氣物質(zhì)進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度條件下MLF對(duì)葡萄酒理化指標(biāo)的影響

表1 供試酒樣MLF發(fā)酵前后理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of wine samples before and after MLF

從表1可以看出，在不同溫度處理?xiàng)l件下，L-乳酸含量顯著升高，說(shuō)明菌株Q19可以使L-蘋(píng)果酸脫羧生成L-乳酸。各處理MLF后葡萄酒中總酸含量都顯著減少，15 ℃和20 ℃發(fā)酵總酸降低最為顯著。揮發(fā)酸含量是判斷葡萄酒健康狀態(tài)的指標(biāo)[15]，也是評(píng)判乳酸菌發(fā)酵特性的指標(biāo)，各處理均低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，其中15 ℃與其他處理組相比，揮發(fā)酸含量最低。另外，各處理組MLF后酒樣中檸檬酸和總糖含量均有微量降低。

2.2 不同溫度條件下MLF過(guò)程中菌密度變化

圖1 不同溫度發(fā)酵菌株Q19菌密度變化Fig.1 Changes in cell density of L.hilgardii Q19 during MLF at different temperatures

如圖1所示，菌株Q19活化后接入葡萄酒中進(jìn)行不同溫度MLF，菌密度均呈現(xiàn)先下降后穩(wěn)定的狀態(tài)。從接種后到第8天，10、15 ℃與20 ℃發(fā)酵酒樣相比，菌密度有明顯的下降；接種8 d后，20 ℃發(fā)酵酒樣的菌密度趨于穩(wěn)定，并保持在107CFU/mL；而10、15 ℃發(fā)酵酒樣的菌密度分別在發(fā)酵24 d和12 d呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，最后趨于穩(wěn)定并保持在106CFU/mL；在接種24 d后，各處理酒樣的菌密度仍保持在106～107CFU/mL。

2.3 不同溫度條件下MLF后葡萄酒中L-蘋(píng)果酸含量的變化

如圖2所示，菌株Q19接入葡萄酒中進(jìn)行不同溫度條件下的MLF，L-蘋(píng)果酸含量均有所下降。接種后第8天，與初始L-蘋(píng)果酸含量相比，10、15 ℃和20 ℃發(fā)酵酒樣中L-蘋(píng)果酸含量分別降低了17.5%、 40.6%和45%；在接種28 d后，10 ℃發(fā)酵酒樣的L-蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度仍有0.87 g/L，盡管菌密度保持在106CFU/mL，說(shuō)明菌株Q19在10 ℃條件下MLF活性受到抑制；而15 ℃發(fā)酵酒樣的L-蘋(píng)果酸降到0.27 g/L，表現(xiàn)出了良好的L-蘋(píng)果酸分解能力，表明菌株Q19在15 ℃條件下具有完成MLF的能力。

圖2 不同溫度發(fā)酵L-蘋(píng)果酸含量變化Fig.2 Changes in L-malic acid content during MLF at different temperatures

2.4 不同溫度條件下MLF后葡萄酒香氣物質(zhì)

如表2所示，酒樣共檢測(cè)到62 種揮發(fā)性化合物，包括18 種醇類，34 種酯類，3 種有機(jī)酸，3 種其他類化合物和4種萜烯類物質(zhì)。其中未經(jīng)MLF的酒樣中香氣物質(zhì)檢測(cè)總量和種類分別為217.48 mg/L和46 種，菌株Q19在10、15 ℃和20 ℃條件下進(jìn)行MLF后，香氣物質(zhì)檢測(cè)總量和種類數(shù)分別為182.55 mg/L和41 種、209.99 mg/L和52 種、194.66 mg/L和48 種。與未經(jīng)MLF的酒樣相比，各處理酒樣香氣物質(zhì)檢測(cè)總量均有所下降，但15 ℃和20 ℃處理顯著增加了可檢測(cè)物質(zhì)的種類，其中15 ℃處理增加了正辛醇、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乳酸乙酯、十一酸乙酯、正癸醛和萜烯類化合物含量，以及萜烯類化合物的種類。

表2 不同溫度條件MLF前后葡萄酒香氣類別及含量Table 2 Types and contents of aroma components in wine before and after MLF at different temperatures

續(xù)表2

2.5 不同溫度條件下MLF后酒樣香氣物質(zhì)的PCA

圖3 不同香氣物質(zhì)在前2 個(gè)主成分上的載荷及處理酒樣分布Fig.3 PC1 versus PC2 loadings plot for different aroma compounds with distribution of experimental and control samples shown in it

為了進(jìn)一步分析不同溫度條件下MLF對(duì)香氣物質(zhì)的影響，將供試酒樣進(jìn)行PCA，以特征值大于1為依據(jù)，提取2 個(gè)主成分，PC1（39.78%）和PC2（33.19%）的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為72.97%。由圖3可知，與PC1高度正相關(guān)的為庚酸乙酯、壬酸乙酯、乳酸乙酯、十一酸乙酯、正辛醇、里那醇、松油烯和β-蒎烯，而乙酸異戊酯、正己酸乙酯、甲酸辛酯和3-甲基-1-戊醇與PC1呈負(fù)相關(guān)；對(duì)PC2起貢獻(xiàn)作用的香氣物質(zhì)主要有苯甲醇、苯乙醇、正癸醇、異戊醇和乙酸苯乙酯等，與辛酸、十三酸乙酯和3-羥基丁酸乙酯呈負(fù)相關(guān)。可以看出，發(fā)酵酒樣中，15 ℃發(fā)酵酒樣在PC1的正半軸得分最高，庚酸乙酯、乳酸乙酯、壬酸乙酯、十一酸乙酯、正辛醇、β-蒎烯、里那醇和松油烯含量較高，賦予葡萄酒獨(dú)特的花香、果香，增加了其香氣復(fù)雜性；20 ℃發(fā)酵酒樣在PC2正半軸的得分較高，對(duì)其香氣起貢獻(xiàn)作用的物質(zhì)主要是香茅醇和異丁醇；10 ℃發(fā)酵酒樣在PC2的負(fù)半軸得分最高，辛酸和3-羥基丁酸乙酯含量較高，使其表現(xiàn)出較多的果香和脂肪味。

3 討 論

希氏乳桿菌Q19在不同溫度條件下進(jìn)行MLF，檸檬酸和總糖含量均有少量降低，表明希氏乳桿菌Q19可以對(duì)糖、檸檬酸進(jìn)行代謝[9]，但本研究中不同溫度條件下MLF后揮發(fā)酸沒(méi)有顯著升高；發(fā)酵溫度對(duì)揮發(fā)酸含量影響不顯著；總酸含量各處理組顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明菌株Q19在MLF過(guò)程中具有一定的降酸能力。

菌株Q19接入葡萄酒中后，各處理酒樣菌密度均呈現(xiàn)先下降后穩(wěn)定的狀態(tài)，在接種8 d后，各處理酒樣的菌密度保持在106～107CFU/mL之間，與Lerm等[24]的研究結(jié)果基本一致，這主要是由于菌株細(xì)胞剛接入葡萄酒中后，其苛刻的環(huán)境導(dǎo)致乳酸菌的生長(zhǎng)速率低于死亡速率，從而導(dǎo)致活菌的數(shù)量下降。在接種28 d后，15 ℃與20 ℃發(fā)酵酒樣的L-蘋(píng)果酸分別降到0.27 g/L和0.15 g/L，而10 ℃酒樣L-蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度仍然保持在0.87 g/L，盡管其菌密度仍保持在106CFU/mL，可能是低溫抑制了其蘋(píng)果酸-乳酸酶活性[25]，且能在低溫下完成MLF可能也與菌株中相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)[26-27]。李維新[25]通過(guò)研究溫度對(duì)蘋(píng)果酸-乳酸酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在生長(zhǎng)溫度為15～35 ℃內(nèi)，植物乳桿菌R23蘋(píng)果酸-乳酸酶的活力隨著溫度的上升而增高。Olguín等[14]通過(guò)對(duì)菌株UNQOe19和UNQOe4分別在18 ℃和21 ℃培養(yǎng)48 h后相關(guān)的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，結(jié)果表明應(yīng)激基因rmlB和hsp20在21 ℃時(shí)表達(dá)水平降低，但在18 ℃表達(dá)量顯著增加。在本研究中，15 ℃較20 ℃發(fā)酵相比，對(duì)菌株Q19消耗蘋(píng)果酸的影響不顯著，而在10 ℃條件下，消耗蘋(píng)果酸能力降低，表明15 ℃對(duì)希氏乳桿菌Q19蘋(píng)果酸-乳酸酶活性影響不顯著，10 ℃可能對(duì)其蘋(píng)果酸-乳酸酶活性產(chǎn)生較大的抑制作用。

對(duì)于揮發(fā)性香氣化合物，低溫發(fā)酵能保留葡萄酒中的一些風(fēng)味物質(zhì)[28]，也是發(fā)酵過(guò)程中唯一能人為控制的因素。葡萄酒中的醇類物質(zhì)主要是由己糖或氨基酸通過(guò)丙酮酸途徑產(chǎn)生，在MLF過(guò)程中，由于乳酸菌菌株代謝過(guò)程中酶活性不同，最終導(dǎo)致代謝產(chǎn)物及次級(jí)代謝產(chǎn)物不同[29]。在各處理中，15 ℃發(fā)酵酒樣高級(jí)醇類物質(zhì)含量最高，其中正辛醇（茉莉、檸檬香）和苯乙醇（玫瑰花香）含量均高于10、20 ℃發(fā)酵，且苯乙醇含量超過(guò)其相應(yīng)的閾值，這為葡萄酒賦予一定的檸檬香、玫瑰花和薔薇等香氣起到積極作用。

酯類物質(zhì)是葡萄酒中重要的揮發(fā)性化合物，大多數(shù)酯類可產(chǎn)生令人愉悅的香氣，通常呈現(xiàn)水果香味[30]。在MLF過(guò)程中，酯類物質(zhì)的合成與水解主要與乳酸菌中的酯酶及其活性有關(guān)[31]。經(jīng)過(guò)不同溫度MLF，15 ℃處理的酯類物質(zhì)種類以及乙醇酯類物質(zhì)含量均高于對(duì)照與其他處理，這些物質(zhì)對(duì)于葡萄酒果香、花香和香料香氣味具有積極的貢獻(xiàn)。Pérez-Martín等[32]研究了溫度對(duì)243 株乳酸菌酯酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)70%的菌株酯酶活性在15 ℃時(shí)高于其他溫度，這對(duì)葡萄酒香氣可能具有潛在的影響。周安玲等[29]在研究乳酸菌對(duì)干紅葡萄酒揮發(fā)性成分影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于泡菜中的植物乳桿菌C5由于其酯酶活性較高，從而促進(jìn)了酯類物質(zhì)的形成。

酸類物質(zhì)除本身是香氣成分外，還能和醇在酯酶催化作用下形成酯類物質(zhì)，增加葡萄汁或酒的香氣物質(zhì)種類[21]。由本研究可知，各處理有機(jī)酸含量均高于對(duì)照組，其中10 ℃發(fā)酵增加了辛酸含量，15 ℃和20 ℃發(fā)酵均降低了辛酸含量，增加了正癸酸含量。

萜烯類化合物來(lái)源于葡萄果實(shí)本身，主要以糖苷鍵合態(tài)形式存在，釀造過(guò)程中可在糖苷酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)閾]發(fā)性的游離態(tài)香氣化合物，從而賦予葡萄酒品種香氣特征[33]。本實(shí)驗(yàn)酒樣共檢測(cè)出4 種萜烯類物質(zhì)，在15 ℃處理酒樣中，這4 種萜烯類物質(zhì)均檢測(cè)出并且總含量最高，對(duì)照和20 ℃發(fā)酵酒樣僅檢測(cè)到香茅醇的存在，10 ℃發(fā)酵酒樣未檢測(cè)到萜烯類物質(zhì)。其中15 ℃發(fā)酵酒樣產(chǎn)生的里那醇（百合花、果香）和香茅醇（檸檬、柑橘香）含量均超過(guò)感官閾值，這些物質(zhì)賦予葡萄酒一定的花香、果香，增加了葡萄酒香氣的復(fù)雜性。羰基類化合物主要來(lái)源于微生物的發(fā)酵，與對(duì)照相比，10 ℃和15 ℃發(fā)酵增加了羰基化合物含量，20 ℃發(fā)酵降低了其含量。其中15 ℃發(fā)酵產(chǎn)生的正癸醛（甜橙和橘子香氣）含量高于對(duì)照和其他處理，且超過(guò)相應(yīng)的感官閾值，這對(duì)酒體香氣特征起重要的貢獻(xiàn)作用。

關(guān)于溫度及其他非生物脅迫對(duì)希氏乳桿菌Q19應(yīng)激基因表達(dá)、酶活性以及有關(guān)物質(zhì)代謝等方面的研究仍需進(jìn)一步探索，以便更深入地理解希氏乳桿菌Q19的生理和代謝特點(diǎn)，為更好地應(yīng)用于生產(chǎn)提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

4 結(jié) 論

希氏乳桿菌Q19在10、15、20 ℃條件下，啟動(dòng)MLF將蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化成乳酸，在15、20 ℃條件下，菌株表現(xiàn)出良好的蘋(píng)果酸分解能力，啟動(dòng)發(fā)酵28 d內(nèi)蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度分別降到0.27 g/L和0.15 g/L，但在10 ℃條件下，啟動(dòng)發(fā)酵28 d內(nèi)蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度仍保持在0.87 g/L，MLF速度受到較大影響。10、15 ℃條件下，菌株對(duì)檸檬酸和糖進(jìn)行了少量的代謝，但發(fā)酵后揮發(fā)酸升高不顯著。在不同溫度條件下，希氏乳桿菌Q19 MLF后的香氣物質(zhì)類別具有顯著差異，與20 ℃發(fā)酵相比，15 ℃條件下發(fā)酵后葡萄酒中香氣物質(zhì)的種類與含量更豐富，其中正辛醇、庚酸乙酯、壬酸乙酯、乳酸乙酯、十一酸乙酯、正癸醛和萜烯類物質(zhì)含量增加，賦予了葡萄酒獨(dú)特的花香、果香等香氣特征。結(jié)果表明希氏乳桿菌Q19能在15 ℃低溫條件下啟動(dòng)并完成MLF，并能提升葡萄酒的香氣質(zhì)量，因而具有較高的商業(yè)化價(jià)值。