楊宇霞，李慧，王爭(zhēng)爭(zhēng)，趙欣，楊林娥，李婷

(山西省生物研究院有限公司，太原 030006)

山西老陳醋是我國傳統(tǒng)四大名醋之一[1-3]，其傳統(tǒng)釀造工藝以高粱、麩皮、谷糠、大麥、豌豆等五谷為原料[4,5]，運(yùn)用低溫酒醪液體發(fā)酵、高溫接種引火、熏淋醋醅結(jié)合制醋、夏伏曬冬撈冰的貯陳老熟等多種方法，經(jīng)“蒸、酵、熏、淋、陳”五個(gè)步驟釀制而成[6]。由于其選料上乘、工藝獨(dú)特[7]，形成了山西老陳醋綿、酸、香、甜、鮮的風(fēng)味特點(diǎn)[8]。有機(jī)酸是山西老陳醋酸味的主要來源[9]，其種類和含量與山西老陳醋的品質(zhì)、風(fēng)味有著密切的關(guān)系[10-12]。

酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和熏蒸是山西老陳醋生產(chǎn)的主要工藝過程[13]。酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵過程是在醋酸菌、酵母菌、霉菌等多種微生物及其所產(chǎn)生的酶類共同作用下進(jìn)行的生物化學(xué)反應(yīng)。酒精發(fā)酵階段伴隨著酒精和二氧化碳大量生成，還有酯類、酸類、醇類等香味物質(zhì)及其前體物質(zhì)的生成[14]；醋酸發(fā)酵過程中，在醋酸菌氧化酒精生成醋酸的同時(shí)，許多其他菌種也共同參與發(fā)酵而生成了多種有機(jī)酸[15]；熏醅階段，醋醅在高溫環(huán)境條件下發(fā)生了水解、美拉德、焦糖化等一系列復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，在此過程中有機(jī)酸與醇類化合物反應(yīng)生成了酯類物質(zhì)。可見，有機(jī)酸的生成及變化貫穿于山西老陳醋發(fā)酵和熏蒸的整個(gè)過程，有機(jī)酸可作為評(píng)價(jià)發(fā)酵及熏醅過程的重要指標(biāo)[16，17]，研究有機(jī)酸的變化對(duì)優(yōu)化山西老陳醋發(fā)酵及熏醅過程工藝參數(shù)、提高山西老陳醋品質(zhì)具有非常重要的意義。

本研究采用高效液相色譜法對(duì)山西老陳醋酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和熏醅過程中的有機(jī)酸進(jìn)行了測(cè)定，分析此過程中有機(jī)酸含量的變化趨勢(shì)，為釀造風(fēng)味獨(dú)特的山西老陳醋提供優(yōu)化工藝的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

取山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝3條生產(chǎn)線酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和熏醅階段的樣品，共計(jì)19個(gè)。分別為酒精發(fā)酵第1天(J1)、第2天(J2)、第3天(J3)、第18天(J18)，醋酸發(fā)酵第1～9天(C1～C9)，熏醅階段第1～6天(X1～X6)。

1.1.2 主要試劑

甲酸(分析純)、乳酸(分析純)、磷酸(優(yōu)級(jí)純)：北京化工廠；蘋果酸(分析純)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸(分析純)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；檸檬酸(分析純)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；琥珀酸(色譜純)、α-酮戊二酸(色譜純)：Sigma-Aldrich公司；甲醇(色譜純)：賽默飛世爾科技(中國)有限公司；亞鐵氰化鉀(分析純)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；硫酸鋅(分析純)：天津歐博凱化工有限公司；磷酸二氫鉀(優(yōu)級(jí)純)：北京精求化工有限責(zé)任公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100型高效液相色譜儀(配有四元泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、可變波長紫外檢測(cè)器和化學(xué)工作站) 美國安捷倫公司；KQ-500D型超聲波清洗儀 東莞市科橋超聲波儀器有限公司；TG16-WS型高速離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；BSA224S型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；NW150V型超純水系統(tǒng) 上?？道追治鰞x器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

酒精發(fā)酵階段：取當(dāng)日酒醅樣品，用濾紙過濾，濾液備用為試驗(yàn)樣品。

醋酸發(fā)酵階段：取當(dāng)日醋醅樣品，稱取10.00 g樣品，加入90 mL新煮沸冷卻的蒸餾水浸泡1 h，然后用濾紙過濾，濾液備用為試驗(yàn)樣品。

熏醅階段：取當(dāng)日熏醅樣品，之后的操作同醋醅樣品。

1.3.2 提取

取2 mL試驗(yàn)樣品，加入2 mL 10.6%亞鐵氰化鉀溶液和2 mL 30%硫酸鋅溶液，用超純水稀釋定容至25 mL，搖勻，10000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，為待測(cè)樣品，上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 色譜分析條件

色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為2.7)∶甲醇為97∶3；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)器：可變波長紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長：210 nm。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取甲酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸0.1000 g，用超純水溶解并定容至10 mL，充分搖勻，保存于4 ℃冰箱備用。使用時(shí)用流動(dòng)相分別稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，見表1。

表1 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度系列Table 1 Organic acid mixture standard solution concentration series μg/mL

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按質(zhì)量濃度由低到高的順序進(jìn)樣分析，以色譜圖中各有機(jī)酸的峰面積對(duì)其相應(yīng)的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制各有機(jī)酸峰面積與質(zhì)量濃度工作曲線，結(jié)果見表2，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

表2 不同有機(jī)酸的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equations and correlation coefficients of organic acids

圖1 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of organic acid standard solution

結(jié)果表明，采用高效液相色譜法測(cè)定各種有機(jī)酸的含量，甲酸質(zhì)量濃度在10～1000 μg/mL、蘋果酸質(zhì)量濃度在5～500 μg/mL、α-酮戊二酸質(zhì)量濃度在1～100 μg/mL、乳酸質(zhì)量濃度在10～1000 μg/mL、乙酸質(zhì)量濃度在10～1000 μg/mL、檸檬酸質(zhì)量濃度在10～1000 μg/mL、琥珀酸質(zhì)量濃度在15～1500 μg/mL時(shí)，各有機(jī)酸質(zhì)量濃度與色譜峰響應(yīng)面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于山西老陳醋發(fā)酵及熏醅過程中有機(jī)酸的定量分析。

2.2 山西老陳醋發(fā)酵及熏蒸過程中各有機(jī)酸含量分析

采用高效液相色譜法測(cè)定山西老陳醋3條生產(chǎn)線酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和熏醅階段的樣品中甲酸、蘋果酸、α-酮戊二酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸7種有機(jī)酸的含量，結(jié)果見表3～表5。

表3 A生產(chǎn)線各有機(jī)酸含量Table 3 Organic acids’ content of production line A

續(xù) 表

表4 B生產(chǎn)線各有機(jī)酸含量Table 4 Organic acids’ content of production line B

表5 C生產(chǎn)線各有機(jī)酸含量Table 5 Organic acids’ content of production line C

由表3～表5結(jié)果可知，山西老陳醋酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和熏醅過程中總有機(jī)酸含量整體呈上升趨勢(shì)，有機(jī)酸總量隨著時(shí)間的延長而逐漸增加，其中醋酸發(fā)酵階段總有機(jī)酸含量增速最快，由醋酸發(fā)酵開始的2000 mg/100 g醋醅上升至醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)的6000 mg/100 g醋醅，提高了3倍多。說明醋酸發(fā)酵階段是山西老陳醋生產(chǎn)過程中有機(jī)酸生成的主要階段。此外，乳酸和乙酸含量占總有機(jī)酸含量的70%以上，是所有有機(jī)酸中最主要的組成部分，乳酸和乙酸含量的變化趨勢(shì)與總有機(jī)酸的變化趨勢(shì)相一致。乳酸是山西老陳醋有機(jī)酸中最主要的不揮發(fā)性有機(jī)酸，大量生成于酒精發(fā)酵后發(fā)酵階段，醋酸發(fā)酵階段前期小幅上升而后緩慢下降，到熏醅階段乳酸含量又略有回升。乙酸是所有有機(jī)酸中含量最多的有機(jī)酸，在山西老陳醋酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和熏醅過程中整體呈上升趨勢(shì)，其中醋酸發(fā)酵階段是乙酸生成的主要階段，尤其是醋酸發(fā)酵的2～4 d，乙酸含量大幅上升。蘋果酸、檸檬酸和琥珀酸是山西老陳醋中含量較豐富的有機(jī)酸，甲酸次之，α-酮戊二酸含量最低。蘋果酸在醋酸發(fā)酵階段變化較小，熏醅階段呈上升趨勢(shì)。琥珀酸整體呈緩慢而平穩(wěn)的上升趨勢(shì)。甲酸在整個(gè)過程中呈較平緩的上升趨勢(shì)，其中醋酸發(fā)酵階段呈先上升后下降又上升的起伏變化現(xiàn)象，可能是由于甲酸屬于含量較低的揮發(fā)性有機(jī)酸，不同生產(chǎn)線間甲酸含量差異較大。α-酮戊二酸是所有有機(jī)酸中含量最低的，酒精發(fā)酵階段其含量較低，主要生成于醋酸發(fā)酵階段，且在醋酸發(fā)酵階段變化比較平穩(wěn)，最后在熏醅階段尤其是熏醅后期含量有較明顯的上升。

3 結(jié)論與討論

山西老陳醋傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵工藝以高粱、麩皮、谷糠等為原料，以大曲作為糖化劑發(fā)酵，霉菌、酵母菌、醋酸菌等多種微生物定向消長、順序代謝，完成釀造過程，是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程。獨(dú)特的原料、復(fù)雜的微生物、特殊的釀造工藝造就了山西老陳醋發(fā)酵和熏醅過程中有豐富的有機(jī)酸產(chǎn)生，多種有機(jī)酸共同作用形成了山西老陳醋酸味醇厚綿長、柔和可口的特點(diǎn)。

研究采用高效液相色譜法對(duì)山西老陳醋酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和熏醅過程中有機(jī)酸進(jìn)行了測(cè)定。從高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果來看，山西老陳醋發(fā)酵和熏醅過程中有機(jī)酸組成比較豐富，且隨著生產(chǎn)過程的進(jìn)行，總有機(jī)酸含量持續(xù)上升。同時(shí)，除乳酸外，酒精發(fā)酵階段各種有機(jī)酸含量均比較低，而乳酸在酒精發(fā)酵后期含量迅速增加，可能是由于乳酸菌屬于厭氧菌，酒精發(fā)酵后期封缸厭氧發(fā)酵狀態(tài)適合于乳酸菌的大量繁殖，從而產(chǎn)生大量乳酸。醋酸發(fā)酵階段是甲酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸和α-酮戊二酸等多種有機(jī)酸生成的主要階段。尤其是乙酸含量由醋酸發(fā)酵開始的100 mg/100 g醋醅上升至醋酸發(fā)酵結(jié)束時(shí)的4000 mg/100 g醋醅，提高了40多倍。熏醅階段各種有機(jī)酸含量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，總有機(jī)酸含量也呈上升趨勢(shì)，但是其中揮發(fā)性酸所占比例呈下降趨勢(shì)，不揮發(fā)性酸所占比例呈上升趨勢(shì)，這與熏醅過程中水分和揮發(fā)性酸的蒸發(fā)有關(guān)系。

在對(duì)山西老陳醋發(fā)酵和熏醅過程中有機(jī)酸研究的基礎(chǔ)上，還需進(jìn)一步對(duì)產(chǎn)生多種有機(jī)酸的相關(guān)微生物進(jìn)行研究，找出其中的對(duì)應(yīng)關(guān)系，以期深入了解山西老陳醋的發(fā)酵機(jī)理，為優(yōu)化山西老陳醋傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝提供一定的理論依據(jù)。