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        人工接種副干酪乳桿菌生產(chǎn)L-乳酸酸菜條件的研究

        2020-09-17 03:01:04劉曉輝陳順李楊敖靜高曉梅孫玉祿
        中國調(diào)味品 2020年9期
        關鍵詞:菌數(shù)酸菜干酪

        劉曉輝,陳順,李楊,敖靜,高曉梅,孫玉祿

        (遼寧省微生物科學研究院,遼寧 朝陽 122000)

        酸菜是我國北方的傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜制品,采用當?shù)卮蟀撞税l(fā)酵而成,其清爽可口、鮮香嫩脆、解膩開胃的品質(zhì)吸引著國內(nèi)外廣大的消費者[1,2]。但普通酸菜中的乳酸基本是D-乳酸。由于人體只有代謝 L-乳酸的L-乳酸脫氫酶[3],D-乳酸在體內(nèi)積累能引起代謝紊亂甚至導致中毒,對人體有害。世界衛(wèi)生組織(WHO)提倡在食品及醫(yī)藥行業(yè)中使用 L-乳酸取代D-乳酸,還明確規(guī)定,人體每天攝取D-乳酸的量限制在100 mg/kg體重以下。副干酪乳桿菌是一種益生菌[4],不但可以產(chǎn)生L-乳酸,而且能夠耐受有機體的防御機制,如口腔中的酶、胃液中胃酸和小腸的膽汁酸等。副干酪乳桿菌進入人體后可以在腸道內(nèi)大量存活,調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡,促進人體消化吸收。同時,副干酪乳桿菌對其宿主營養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效。基于以上原因,本試驗采用可以產(chǎn)L-乳酸的副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)作為生產(chǎn)菌種,通過本試驗研究出最佳生產(chǎn)條件,為L-乳酸酸菜的工廠化生產(chǎn)提供了理論基礎。由于純種發(fā)酵的L-乳酸酸菜亞硝酸鹽濃度一直很低,所以此試驗沒有將亞硝酸鹽含量作為檢測指標[5-9],只將乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量作為檢測指標。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 原料

        白菜:購于超市。

        1.1.2 試劑

        檸檬酸銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀、亞鐵氰化鉀、乙酸、鹽酸萘乙二胺、硼砂、對氨基苯磺酸、濃鹽酸、乙酸鋅(均為分析純):天津市風船化學試劑科技有限公司;D/L-乳酸檢測試劑盒:愛爾蘭Megazyme公司,購于賽恩斯(北京)儀器有限公司。

        1.1.3 儀器

        SHP-150恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏設備有限公司;SX-500型全自動高溫高壓滅菌鍋 TDMY KOGYO公司;722S分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司;SA-900-1JZ超凈工作臺 上海一恒科技有限公司;JA2103N電子天平 上海精密科學儀器有限公司;小號缸;各種玻璃儀器等。

        1.1.4 菌種

        乳酸菌菌種:副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)本實驗室冰箱4 ℃保藏。

        1.1.5 培養(yǎng)基配制

        MRS培養(yǎng)基:牛肉膏10 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,葡萄糖10 g,乙酸鈉5 g,檸檬酸三銨2 g,吐溫80 1 g,K2HPO42 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·4H2O 0.05 g,水1000 mL,pH自然。分裝到500 mL三角瓶中,121 ℃高壓滅菌15 min,備用。

        1.2 方法

        1.2.1 菌種活化

        將冰箱4 ℃保藏的菌種接入上述培養(yǎng)基中,放置培養(yǎng)箱中32 ℃培養(yǎng)24 h,傳種2代,鏡檢無雜菌備用。

        1.2.2 酸菜中Vc含量檢測[10-12]

        采用GB 5009.86-2016《食品安全國家標準 食品中抗壞血酸的測定》中的2,6-二氯靛酚滴定法。

        1.2.2.1 樣品處理

        稱取切碎的酸菜樣品20.00 g,放在研缽中加2%草酸溶液少許研碎,倒入200 mL容量瓶中,加2%草酸溶液至刻度,用離心機離心沉淀后過濾備用。

        1.2.2.2 樣品測定

        吸取10.0 mL濾液于燒杯中,用2,6-二氯靛酚鈉鹽溶液滴定至桃紅色20 s不褪色,記下染料的用量。吸取2%草酸溶液,用染料作空白滴定記下用量。

        1.2.2.3 結(jié)果計算

        按照GB 5009.86-2016的計算公式。

        1.2.3 L-乳酸含量檢測[13,14]

        按照D/L-乳酸檢測試劑盒執(zhí)行。

        表1 L-乳酸檢測步驟Table 1 The detection procedure of L-lactic acid

        1.2.3.1 樣品處理

        酸菜汁離心,必要時進行稀釋,使L-乳酸濃度到0.003~0.30 g/L之間;溫育到25 ℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3.2 樣品測定

        按照表1步驟檢測。

        1.2.3.3 結(jié)果計算

        式中:C為L-乳酸濃度(g/L),V為最終體積(mL),MW為L-乳酸的分子量(g/mol),ε為NADH在340 nm處的消光系數(shù)=6300(1/mol×cm),d為光路(cm),v為樣品體積(mL)。

        如果樣品在制備階段已經(jīng)稀釋,結(jié)果必須乘以稀釋系數(shù)F。

        1.2.4 乳酸菌計數(shù)[15,16]

        按照GB 4789.35—2016執(zhí)行。

        1.2.5 發(fā)酵條件[17,18]

        1.2.5.1 不同發(fā)酵溫度對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

        將白菜除爛葉后,用清水沖洗,將白菜擺放在缸中,每缸放10 kg,壓實,加2%溫度為40 ℃的鹽水剛好超過白菜,加入5%液體副干酪乳桿菌菌種,封口,分別在25,28,32,35,37,39 ℃發(fā)酵12 d,檢測乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

        1.2.5.2 不同食鹽濃度對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

        將白菜除爛葉后,用清水沖洗,將白菜擺放在缸中,每缸放10 kg,壓實,分別加1%、2%、4%、6%、8%、10%溫度為40 ℃的鹽水剛好超過白菜,加入5%液體副干酪乳桿菌菌種,封口,32 ℃發(fā)酵12 d,檢測乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

        1.2.5.3 不同接菌量對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

        將白菜除爛葉后,用清水沖洗,將白菜擺放在缸中,每缸放10 kg,壓實,加2%溫度為40 ℃的鹽水剛好超過白菜,分別加入1%、3%、5%、7%、9%的液體副干酪乳桿菌菌種,封口,32 ℃發(fā)酵12 d,檢測乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

        1.2.5.4 不同發(fā)酵時間對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

        將白菜除爛葉后,用清水沖洗,將白菜擺放在缸中,每缸放10 kg,壓實,加2%溫度為40 ℃的鹽水剛好超過白菜,加入5%的液體副干酪乳桿菌菌種,,封口,32 ℃發(fā)酵,發(fā)酵時間為3,6,9,12,15 d。在蔬菜汁pH值達到3.5時檢測乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

        1.2.5.5 不同初始水溫對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

        將白菜除爛葉后,用清水沖洗,將白菜擺放在缸中,每缸放10 kg,壓實,加2%溫度為55,50,45,40,35,30,25 ℃和自來水的鹽水剛好超過白菜,加入5%的液體副干酪乳桿菌菌種,封口,32 ℃發(fā)酵12 d,檢測乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量和Vc含量。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同發(fā)酵溫度對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

        圖1 溫度對Vc和L-乳酸的影響Fig.1 The effect of temperature on Vc and L-lactic acid

        由圖1可知,發(fā)酵溫度為32 ℃時乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量最高,隨發(fā)酵溫度升高,乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量都有所下降,這是因為溫度過高不適應此副干酪乳桿菌生長,同時影響L-乳酸的產(chǎn)量。隨發(fā)酵溫度升高,Vc含量減少,這與Vc不耐高溫有關,在32 ℃時Vc含量降低相對少,故確定酸菜最佳發(fā)酵溫度為32 ℃。

        2.2 不同食鹽濃度對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響[19]

        圖2 食鹽濃度對Vc和L-乳酸的影響Fig.2 The effect of salt content on Vc and L-lactic acid

        由圖2可知,食鹽濃度為4%時乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量最高,但此時Vc含量相對低,在食鹽濃度為2%時Vc含量相對高,乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量與食鹽濃度為4%時相差不大,再加之提倡低鹽健康飲食,最佳酸菜發(fā)酵食鹽濃度選擇2%。由圖2還可知,食鹽濃度過高,L-乳酸含量隨之降低,是因為過高的食鹽抑制了乳酸菌的生長,從而降低了L-乳酸含量,食鹽濃度高也會加快Vc含量降低。

        2.3 不同接菌量對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響[20]

        圖3 接菌量對Vc和L-乳酸的影響Fig.3 The effect of inoculation amount on Vc and L-lactic acid

        由圖3可知,在接菌量為5%時乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸和Vc含量均為最高,接菌量為1%和3%時、由于接菌量低發(fā)酵較慢,乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量低,L-乳酸對Vc有一定的保護作用,在低濃度的L-乳酸環(huán)境中Vc含量下降快,接菌量為7%和9%時,由于接菌量過大、營養(yǎng)缺乏抑制了乳酸菌生長繁殖,乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量較低,缺少L-乳酸的保護、Vc含量也有所下降,由此確定酸菜最佳接菌量為5%。

        2.4 不同起始水溫對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

        圖4 起始水溫對Vc和L-乳酸的影響Fig.4 The effect of initial water temperature on Vc and L-lactic acid

        由圖4可知,不同起始水溫對乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸的產(chǎn)生速度有較大影響,初始水溫太高,菌種受到抑制使菌數(shù)少,產(chǎn)酸慢,當初始水溫在45 ℃的乳酸菌菌數(shù)最高,產(chǎn)酸最快,這是因為45 ℃的水加入白菜中,整體溫度在32 ℃左右,最適合此菌種發(fā)酵,隨著初始水溫的降低,發(fā)酵速度隨之降低,菌數(shù)和L-乳酸含量也會減少。初始水溫高會大大降低Vc含量,隨著初始水溫降低,Vc含量降低速度減慢。初始水溫45 ℃時菌數(shù)和L-乳酸含量高,但Vc含量低,在初始水溫40 ℃時的菌數(shù)和L-乳酸含量與初始水溫45 ℃的含量差別不大,這時Vc含量降低較少,所以初始水溫選擇40 ℃。

        2.5 不同發(fā)酵時間對酸菜中Vc含量和酸菜汁中乳酸菌菌數(shù)、L-乳酸含量的影響

        圖5 發(fā)酵時間對Vc和L-乳酸的影響Fig.5 The effect of fermentation time on Vc and L-lactic acid

        由圖5可知,酸菜最佳發(fā)酵時間為12 d,在發(fā)酵第12天時乳酸菌菌數(shù)和L-乳酸含量最高,L-乳酸含量達到最高值31.35 mg/kg,隨時間增加,L-乳酸含量變化不大,這是由于達到一定酸度對乳酸菌有一定抑制作用,基本停止發(fā)酵,L-乳酸含量不變,又因為酸度過強殺死少量乳酸菌,乳酸菌菌數(shù)略有下降。由圖5還可知,Vc含量隨發(fā)酵時間增加而降低,在第12天時Vc含量為16.58 mg/100 g,相對原料白菜Vc含量為19.24 mg/100 g下降不大,故確定酸菜最佳發(fā)酵時間為12 d。

        3 結(jié)論

        人工接種副干酪乳桿菌發(fā)酵酸菜試驗表明最適發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度32 ℃、食鹽濃度2%、接種量5%、初始水溫40 ℃、發(fā)酵時間12 d,在該條件下成品酸菜中乳酸菌菌數(shù)對數(shù)值為12 CFU/mL,L-乳酸含量為31.35 mg/kg,Vc含量為16.58 mg/100 g。

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