李娜,武曉英*,趙文婧,翟飛紅,李曉君
(1.太原師范學(xué)院 生物系,山西 晉中 030619;2.中北大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院,太原 030051)
牛至(OriganumvulgareL.),又名滿坡香、蘑菇草、披薩草、五香草、小葉薄荷、花八角、野荊芥、止痢草、馬郁蘭、土香薷等,為唇形科牛至屬多年生草本或半灌木植物,在我國(guó)主要分布于河南、江蘇、浙江、安徽、江西、福建、湖北、湖南、陜西、甘肅、新疆等地區(qū)[1]。牛至是一種藥食同源植物,具有較高的藥用和食用價(jià)值。牛至全草都可入藥,具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤等作用,在生物農(nóng)藥、殺蟲(chóng)劑、抗氧化劑等天然產(chǎn)物[2,3]中的應(yīng)用前景廣闊,同時(shí),牛至常作為一種烹飪調(diào)味料使用,用于烘烤類的烹飪以及肉類的除腥提鮮等,是一種天然的調(diào)味品及香料。
牛至精油是從牛至莖葉中提取得到的淡黃色澄清油狀液體,揮發(fā)性很強(qiáng),不易保存[4],組成牛至精油的酚類化合物和萜烯類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗菌和抗氧化活性[5],評(píng)價(jià)牛至精油抗菌活性及殺菌效果的關(guān)鍵指標(biāo)是香芹酚和百里香酚的含量和比例[6,7]。牛至精油中的主要抗氧化活性成分是酚酸類和萜類化合物[8,9]。酚酸類化合物苯環(huán)上的酚羥基是一種抗氧化活性基團(tuán),脫氫產(chǎn)生的苯氧自由基的穩(wěn)定性與其清除自由基活性密切相關(guān)[10]。萜類化合物具有異戊二烯骨架并含有多個(gè)烯鍵,其化學(xué)性質(zhì)活潑,并具有較強(qiáng)的還原性,可保護(hù)細(xì)胞膜和線粒體中的不飽和脂肪酸免受氧化,并保持膜的功能和完整性[11]。此外,牛至精油還具有毒性低、使用安全、成本低和經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)點(diǎn)[12],因此,牛至精油已廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜等食品的保鮮防腐領(lǐng)域。
目前關(guān)于香辛料的研究報(bào)道較多,尤其是對(duì)香辛料精油的研究更為廣泛,如八角茴香精油、花椒精油、肉桂精油等[13-16]。而對(duì)牛至這種調(diào)味品的研究相對(duì)較少,尤其對(duì)牛至精油成分的分析缺乏系統(tǒng)的總結(jié)和探討。因此,本文采用水蒸氣蒸餾法提取牛至精油,并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析牛至精油的組成成分。以BHT(2,6-二叔丁基對(duì)甲酚)作為對(duì)照,對(duì)牛至精油清除DPPH和ABTS自由基能力進(jìn)行測(cè)定,初步探究牛至精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力,為牛至精油的綜合開(kāi)發(fā)利用提供了參考。
牛至:購(gòu)自亳州仙養(yǎng)御膳藥業(yè)有限公司;正己烷(色譜純):Aladdin試劑公司;DPPH(分析純)、ABTS(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;所有其他有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
供試菌株:大腸桿菌(EscherichiacoilCGMCC 44568)、金黃色葡萄球菌(StaphylococusaureusCGMCC 26085)均購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。
1.2.1 牛至精油提取
采用水蒸氣蒸餾法提取牛至精油:將干燥牛至粉碎,過(guò)80目篩,置于圓底燒瓶中,以料液比1∶10加入蒸餾水,100 ℃進(jìn)行提取,至無(wú)油狀物餾出為止。
1.2.2 精油提取率測(cè)定
采用—定質(zhì)量的牛至粉碎物提取所得精油的質(zhì)量來(lái)計(jì)算精油提取率;按公式(1)計(jì)算:
(1)
1.2.3 牛至精油組成成分GC-MS檢測(cè)
采用Trace 1300系列氣相色譜與ISQ單四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器(Thermo Fisher Scientific,USA)相連,與氣相色譜連接的柱子為T(mén)R-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。檢測(cè)升溫程序:55 ℃保持3 min,以3 ℃/min的速率升到250 ℃,保持5 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;檢測(cè)器溫度280 ℃;載氣為氦氣,流速1 mL/min。精油處理后以色譜純正己烷稀釋,進(jìn)樣量1 μL,分流比5∶1。質(zhì)譜條件:電離能量為70 eV的電子轟擊源,電子電離質(zhì)譜范圍在33~550 m/z。
1.2.4 牛至精油抗氧化性測(cè)定
1.2.4.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定
取0.3 mL不同濃度的牛至精油樣品于試管中,分別加入2.7 mL 60 μmol/L的DPPH甲醇溶液,室溫下在黑暗中反應(yīng)30 min,在518 nm處測(cè)量吸光度值。以無(wú)水甲醇為空白參照,以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)公式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率,并計(jì)算半數(shù)抑制率IC50值。
(2)
式中:I為牛至精油對(duì)DPPH·的清除率;A0為DPPH·空白對(duì)照的吸光度值;As為樣品與DPPH·反應(yīng)后的吸光度值。
1.2.4.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定
將7 mol/mL的ABTS和2.5 mol/mL的過(guò)硫酸鉀溶液在室溫下以等體積混合,并在黑暗中反應(yīng)12~16 h以獲得ABTS+·工作液。然后將獲得的ABTS+·工作液用80%乙醇稀釋,使其OD值在734 nm的條件下測(cè)得為0.7,備用。取0.3 mL不同濃度的牛至精油樣品于試管中,加入2.7 mL ABTS+·工作液,混勻,暗反應(yīng)30 min,以無(wú)水乙醇為空白參照,以BHT為陽(yáng)性對(duì)照,在734 nm處依次測(cè)量吸光度值,根據(jù)公式(3)計(jì)算ABTS自由基清除率,并計(jì)算出半數(shù)抑制率IC50值。
(3)
式中:I為牛至精油對(duì)ABTS+·的清除率;A0為ABTS+·空白對(duì)照的吸光度值;As為樣品與ABTS+·反應(yīng)后的吸光度值。
1.2.5 牛至精油抗菌活性研究
將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌置于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,然后用無(wú)菌水將活化的菌種稀釋,配制細(xì)菌懸浮液,使細(xì)菌懸浮液中含有約106CFU/mL的細(xì)菌數(shù)量。移取100 μL不同供試菌種的細(xì)菌懸浮液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上制成含菌平板。將3個(gè)已滅菌的圓形濾紙片(6 mm) 等距放置在每個(gè)含菌平板上,其中一個(gè)滴加5 μL蒸餾水作為空白對(duì)照,向另外兩個(gè)中滴加5 μL牛至精油,把含菌平板置于37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h。測(cè)定抑菌圈直徑,每個(gè)菌種重復(fù)3次。
采用水蒸氣蒸餾法提取牛至精油,約需4 h,不再有精油餾出,即完成提取。平均提取率為0.15%,通過(guò)水蒸氣蒸餾法獲得的精油是淡黃色透明油狀液體,具有濃烈的香氣。
牛至精油揮發(fā)性成分總離子流圖見(jiàn)圖1。
圖1 牛至精油揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile compounds of essential oils from oregano
實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出54種精油組成成分。利用峰面積歸一化法并與NIST數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比及查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料,列出各組分及其相對(duì)含量,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 牛至精油化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of essential oils from oregano
續(xù) 表
由表1可知,分析出54種相對(duì)含量為0.1%以上的化合物,占精油總含量的91.04%,其中,牛至精油的主要成分是酚類和萜烯類化合物。有4種相對(duì)百分含量較高的化合物成分,分別是百里香酚(26.63%)、香芹酚(14.44%)、2-異丙基-1-甲氧基-4-甲基苯(11.75%)和松油烯(9.23%)。牛至精油的組成成分受客觀因素的影響較大,如氣候、土壤以及收獲時(shí)間等,因此,本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[17-20]報(bào)道的有所不同,但也有多種共有成分,如α-蒎烯、檸檬烯、百里香酚、香芹酚、松油烯、石竹烯、法尼烯等。
圖2 化合物質(zhì)譜對(duì)比圖及其結(jié)構(gòu)式Fig.2 Comparison of mass spectra of compounds and their chemical structures
2.3.1 牛至精油清除DPPH自由基能力
DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)基團(tuán),DPPH 溶液在518 nm波長(zhǎng)處有很強(qiáng)的吸收峰,具有特征性顏色紫色。當(dāng)加入抗氧化物質(zhì)時(shí),來(lái)自抗氧化劑的1個(gè)電子與穩(wěn)定的DPPH·電子配對(duì),因此,DPPH的特征紫色變淡,抗氧化劑的濃度越高,DPPH溶液的顏色越淺,因此可根據(jù)加入抗氧化劑前后DPPH溶液吸光度值的變化來(lái)確定物質(zhì)的抗氧化能力。牛至精油和BHT對(duì)DPPH自由基的清除能力結(jié)果見(jiàn)圖3。
由圖3可知,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),隨著牛至精油和BHT濃度的增加,二者對(duì)DPPH自由基的清除能力都呈現(xiàn)對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì),其半數(shù)抑制率IC50值分別為1.41 μg/mL和4.10 μg/mL??梢?jiàn),牛至精油清除DPPH 自由基的能力優(yōu)于化學(xué)合成的抗氧化劑BHT,即牛至精油具有更強(qiáng)的抗氧化性。
圖3 牛至精油(A)和BHT (B)對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging capacity of oregano essential oils (A) and BHT (B) to DPPH·
2.3.2 牛至精油清除ABTS自由基的能力測(cè)定
ABTS在合適的氧化劑作用下被氧化成綠色的ABTS+·,并在抗氧化物存在時(shí)抑制ABTS+·的產(chǎn)生,使得綠色變淡,因此在734 nm處測(cè)量加入抗氧化物質(zhì)前后ABTS+·的吸光度值變化,可以計(jì)算出樣品的總抗氧化能力。牛至精油和BHT對(duì)ABTS自由基的清除能力結(jié)果見(jiàn)圖4。
圖4 牛至精油(A)和BHT(B)對(duì)ABTS+·的清除能力Fig.4 The scavenging capacity of oregano essential oils (A) and BHT (B) to ABTS+·
由圖4可知,在測(cè)量范圍內(nèi),隨著牛至精油和BHT濃度的增加,二者對(duì)ABTS+·的清除能力都呈現(xiàn)出對(duì)數(shù)增加,半數(shù)抑制率IC50分別為0.0103 μg/mL和1.3596 μg/mL。因此,牛至精油清除ABTS+·的能力顯著優(yōu)于BHT,即牛至精油具有比化學(xué)合成的抗氧化劑BHT更強(qiáng)的抗氧化活性。
牛至精油對(duì)大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌效果見(jiàn)圖5。
圖5 牛至精油對(duì)大腸桿菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)的抑菌圈Fig.5 The inhibition zone of oregano essential oils against Escherichia coli (A) and Staphylococcus aureus (B)
牛至精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為9.5 mm和6.5 mm,由此可以看出,同種精油對(duì)不同菌種具有不同的抑菌活性,在同等條件下,牛至精油對(duì)大腸桿菌的抑菌活性比對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性更強(qiáng),牛至精油對(duì)大腸桿菌屬中敏感度,對(duì)金黃色葡萄球菌屬低敏感度,本結(jié)果與錢(qián)驊等[21]的研究結(jié)果一致,表明牛至精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有較強(qiáng)的抑制作用。
本研究以天然植物牛至的次級(jí)代謝產(chǎn)物——牛至精油為研究對(duì)象,運(yùn)用GC-MS技術(shù)分析了牛至精油的化學(xué)成分,并對(duì)其抗氧化性和抑菌性進(jìn)行了初探。牛至精油主要含有酚類物質(zhì)(如百里香酚、香芹酚等)及烯類物質(zhì)(如松油烯、石竹烯、檸檬烯等)等,具有良好的抗氧化性和抗菌活性。牛至精油對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均有較強(qiáng)的清除能力,且清除能力都優(yōu)于化學(xué)合成的抗氧化劑BHT。牛至精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都具有顯著的抑菌性,而且在同等條件下,牛至精油對(duì)大腸桿菌的抑菌活性比對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性更強(qiáng)。因此,牛至精油具有來(lái)源安全、效果好等優(yōu)點(diǎn)。本研究為牛至精油在食品保鮮、農(nóng)藥開(kāi)發(fā)、動(dòng)物免疫等方面的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了一定的科學(xué)依據(jù)。