謝宇鋒，余云進(jìn)，楊錦蘭，陳 赟，馮 軍△，楊宗保

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518034； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361005)

胃熱證主要表現(xiàn)為胃火熾盛、胃脘灼痛等實(shí)熱癥狀，是熱證中的典型病證。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，胃熱證大鼠的胃黏膜組織出現(xiàn)損傷、炎性病變等病理學(xué)改變[1-2]，故胃熱證與胃黏膜損傷的相關(guān)病變具有一致性。灸法作為中醫(yī)的特色療法，具有適應(yīng)癥廣泛、便于使用的特點(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灸法對(duì)胃黏膜損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用[3-4]。古往今來，雖然灸法用于治療熱證的理論探討和實(shí)踐諸多，但因其相關(guān)的實(shí)驗(yàn)開展較少，具體的作用機(jī)制尚未揭示。

胃黏膜屏障對(duì)胃黏膜損傷具有防御作用，其防御機(jī)制由黏液-碳酸氫鹽屏障、黏膜屏障等相互協(xié)調(diào)而成[5]。三葉因子2(Trefoil Factor Family 2，TFF2)是胃黏膜的重要保護(hù)因子，一定程度上反應(yīng)了胃黏膜屏障的防御功能。據(jù)此，本研究擬通過研究麥粒灸對(duì)胃熱證胃黏膜損傷大鼠胃黏膜屏障的影響，以闡釋麥粒灸對(duì)胃黏膜保護(hù)作用的機(jī)制及“熱證可灸”理論的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(150±20)g，購買自上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司[許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005]，飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)環(huán)境7 d后開始實(shí)驗(yàn)，室溫控制在20～22℃，相對(duì)濕度65%～70%,自然光明暗周期，自由飲食。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 勻漿機(jī)(德國IKA公司,型號(hào)：IKA T10 basic)；高速低溫離心機(jī)(SCILOGBX，型號(hào)D3024R)；低速離心機(jī)(SCILOGBX，型號(hào)：S1010E);基因擴(kuò)增儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：ETC811)；超微量分光光度計(jì)(NannoVue，型號(hào)：NanoVue Plus)；熒光定量PCR儀(天隆科技,型號(hào)：Gentier96E)；GloMax酶標(biāo)儀(Promega，型號(hào)：GM3030)；病理切片機(jī)(Leica,型號(hào):CM1850)；智能生物顯微鏡(奧林巴斯Olympus公司，型號(hào):BX53)。

1.2.2 試劑 辣椒粉(泰州春和源食品有限公司，許可證號(hào)：SC10332128102093)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20190213)；TFF2 ELISA試劑盒(Elabscience科技生物公司，貨號(hào)：R1873)；RNA提取試劑盒(艾德萊生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：RN03)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，貨號(hào)：FSQ-101)；無毒性核酸染色劑[生物工程(上海)股份有限公司，貨號(hào)：EA26BA0029]。

1.3 造模與分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、麥粒灸組。胃熱證胃黏膜損傷模型制備：參照ZOU Z J等[6]方法進(jìn)行造模。將80 g辣椒干粉混入1 L的純水中，經(jīng)120目篩過濾后制成辣椒混懸液(80 mg/mL)。模型組大鼠、麥粒灸組大鼠灌胃辣椒混懸液(10 mL/kg)，每天經(jīng)口灌胃2次，連續(xù)6 d，第6天灌胃結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，于第7天灌胃無水乙醇(1 mL)1次。結(jié)束后3 h大鼠恢復(fù)自由飲食。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 選穴方法 根據(jù)課題組前期研究艾灸干預(yù)胃熱證胃黏膜損傷機(jī)制，麥粒灸組治療選用足陽明胃經(jīng)梁門、足三里為治療穴位[7]，參照李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]對(duì)大鼠的穴位定位。大鼠梁門穴位于腹部正中線與乳頭之間連線的中點(diǎn)，臍上約20 mm；大鼠足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處。將所選穴位穴區(qū)使用脫毛膏脫毛、并用濕棉簽將鼠毛擦拭干凈，隨后對(duì)穴區(qū)使用苦味酸進(jìn)行標(biāo)記。

1.4.2 艾灸方法 造模結(jié)束后第2天開始治療。將所有麥粒灸組大鼠仰臥朝上用鼠板固定，用鑷子放置麥粒于穴位上(將1 mg純艾絨捏制為基底部2.5～3.0 mm、高度4～5 mm的麥粒)，線香點(diǎn)燃，每個(gè)穴位共灸7個(gè)麥粒，每個(gè)麥粒的燃燒時(shí)間為10～12 s，期間用紅外線測(cè)溫儀監(jiān)測(cè)施灸部溫度，溫度控制45～48℃。麥粒灸1次/d,共7 d。正常組和模型組大鼠同樣捆綁固定，不做麥粒灸治療。

1.5 樣本采集

所有組別大鼠于第7天麥粒灸治療結(jié)束后禁食不禁水，12 h后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，用手術(shù)器械剖開大鼠腹部，充分暴露腹主動(dòng)脈并取血5 mL,血漿于常溫靜置1 h后,離心5 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min),離心后用取使用移液槍將血清吸取,移置于凍存管，并放入-80℃冰箱保存，備用于ELISA檢測(cè)。用手術(shù)剪將大鼠全胃取出分離，沿胃大彎剪開，在生理鹽水中洗凈，隨后充分展開胃黏膜，觀察胃黏膜情況，將胃黏膜組織分成2份，一份放入10%多聚甲醛中固定24～48 h，包埋、切片、染色。另一份胃黏膜組織迅速置入液氮冷凍保存，1 h后移入-80℃冰箱，用于QT-PCR檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠一般行為學(xué)觀察 ①外觀：唇、舌、趾、爪、耳、毛發(fā)顏色;②精神活動(dòng)狀態(tài)：精神狀態(tài)正常，喜靜，喜動(dòng)，興奮，叫聲嘶啞或響亮;③大小便情況：小便色黃或色清，大便正常、秘結(jié)或稀溏。

1.6.2 胃黏膜組織病理學(xué)光鏡 胃黏膜組織在固定結(jié)束后進(jìn)行梯度酒精脫水、包埋、二甲苯透明、切片。隨后采用HE染色，在400倍光鏡下觀察胃黏膜組織病理形態(tài)并采集圖片。

1.6.3 實(shí)時(shí)熒光定量(QT-PCR)檢測(cè)胃黏膜組織TFF2、腫瘤壞死因子(TNF-α) 稱取約100 mg組織樣品，加液氮研磨，用1 mL trizol室溫裂解5 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min；取上清，按常規(guī)方法提取總RNA，隨后進(jìn)行RNA濃度測(cè)定，取1 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，總體系10 μL，制備cDNA模板。按照說明書進(jìn)行TFF2 mRNA、TNF-α mRNA的RT-PCR檢測(cè)，以β肌動(dòng)蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，引物序列見表1，用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)定TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)Ct值，將獲得目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值，得到△Ct值后，采用2-△△Ct方法[9]分析mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 RT-PCR檢測(cè)引物信息表

1.6.4 血清TFF2含量檢測(cè) ELISA測(cè)定血清TFF2含量。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般行為學(xué)比較

正常組大鼠毛發(fā)光亮，外觀顏色正常，精神狀態(tài)好，大小便情況無異常;模型組大鼠的毛發(fā)發(fā)黃，唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅，喜動(dòng)，暴躁，叫聲嘶啞，小便色黃，大便干結(jié)量少;麥粒灸組大鼠較模型組大鼠好轉(zhuǎn)，外觀顏色有所改善，大小便情況較正常。

2.2 各組大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)比較

正常組胃黏膜皺襞完整、結(jié)構(gòu)清晰、層次分明，未見損傷或脫落;模型組胃黏膜出現(xiàn)皺襞萎縮、上皮細(xì)胞脫落壞死，細(xì)胞間隙增寬，炎癥細(xì)胞浸潤;麥粒灸組胃黏膜皺襞破損有所恢復(fù)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及固有腺體基本正常，炎癥浸潤減輕。見圖1。

注：A、B、C分別為正常組、模型組、麥粒灸組。圖1 大鼠胃黏膜組織病理學(xué)結(jié)果(400×)

2.3 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)比較

相比正常組，模型組大鼠胃黏膜組織中的TFF2 mRNA含量表達(dá)降低(P<0.01)、TNF-α mRNA表達(dá)升高(P<0.01),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在麥粒灸組中TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)較模型組接近正常組(P<0.01或P<0.05)，結(jié)果顯示干預(yù)后含量得到有效逆轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖2。

表2 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA和TNF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量

注：a為TFF2 mRNA,b為TNF-α mRNA。圖2 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)量(n=8)

2.4 各組大鼠血清TFF2含量比較

相比正常組，模型組大鼠的血清TFF2含量表達(dá)降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在麥粒灸組中的表達(dá)較模型組接近正常組，與模型組相比，麥粒灸組表達(dá)量差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清TFF2含量變化

3 討論

灸法治療熱證屬于反佐治法，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中便提出：“寒熱虛實(shí)，火當(dāng)自之”，《素問·六元正紀(jì)大論》云：“火郁發(fā)之”，均為“熱證可灸”奠定了理論基礎(chǔ)。歷代不少醫(yī)家對(duì)“熱證可灸”均付諸于實(shí)踐，如金元四大家之一的朱丹溪在針灸臨床中運(yùn)用“灸治實(shí)熱證”和“灸治虛熱證”[10]，《千金翼方》則記載：“胃中熱，灸三里三十壯?！笔埂盁嶙C可灸”得到佐證和發(fā)展。至現(xiàn)代研究則揭示，艾灸能從抗感染、體液代謝、中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平和免疫功能等調(diào)節(jié)作用于熱證[11]。麥粒灸是灸法的分支之一，是用麥粒狀大的艾柱直接灸的一種方法，具有灸量大、療效顯著的特點(diǎn)，相比傳統(tǒng)艾灸，麥粒灸溫?zé)嵋鸬淖仆锤袦p小、瘢痕形成相對(duì)少、適應(yīng)病癥廣泛、易于被患者所接受。在主治功能上，麥粒灸具有既能祛寒又可泄熱的雙向性特點(diǎn)[12]。本課題組早期的研究也表明，艾灸足陽明胃經(jīng)穴“梁門”“足三里”對(duì)胃熱證大鼠胃黏膜損傷的修復(fù)有促進(jìn)作用[7]，但灸法治療熱證的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，所以本研究以胃黏膜屏障為切入點(diǎn)，研究麥粒灸胃經(jīng)穴促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制。

胃黏膜屏障主要包括胃黏液屏障和胃黏膜上皮屏障。而胃黏液屏障在胃黏膜屏障中起著核心的作用，既可以使胃黏膜上皮對(duì)胃內(nèi)容物產(chǎn)生機(jī)械損傷和防御作用，又可以抑制胃酸和胃蛋白酶，使胃黏膜上皮的被侵蝕減少。胃黏液屏障主要包括黏蛋白、水、電解質(zhì)、三葉肽(Trefoil factor family,TFFs)以及脂類，覆蓋于胃黏膜上皮細(xì)胞表面[13]。TFFs是胃黏液屏障的主要組成成分之一，包含了乳癌相關(guān)肽(pS2或TFF1)、解痙多肽(SP或TFF2)和腸三葉因子(ITF或TFF3)[14]。作為黏液層的一個(gè)主要組成成分，TFFs可以將胃黏液層中的另一個(gè)重要組成成分黏蛋白連接起來，使單獨(dú)的黏蛋白形成相互重疊、相互穿插的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使黏液凝膠層的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而對(duì)胃黏膜產(chǎn)生保護(hù)作用[15]。Thim L等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TFFs含量下降，會(huì)導(dǎo)致胃黏膜的黏蛋白結(jié)合形成的多聚體下降，胃黏液凝膠結(jié)構(gòu)變得松散、黏液層萎陷。因此，TFFs的含量可以作為反映胃黏液屏障功能的重要指標(biāo)。TFF2是三葉因子家族中的重要成員，主要分布在胃竇和十二指腸等消化性潰瘍易發(fā)部位。有研究表明，非甾體藥物誘導(dǎo)的潰瘍?cè)赥FF2基因敲除的小鼠中更為敏感[17]。相關(guān)研究表明，給予外源性的TFFs可以減輕NSAIDs、乙醇以及應(yīng)激導(dǎo)致的胃黏膜損傷，也可以促進(jìn)傷口愈合的速度[18-19]，在體內(nèi)出現(xiàn)損傷時(shí)，TFF2能通過細(xì)胞遷移以保護(hù)胃黏膜受損[20]。因此，TFFs不僅可以反映胃黏膜屏障的功能，而且是重要的胃黏膜保護(hù)因子。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃熱證證候下大鼠毛發(fā)發(fā)黃，唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅以及喜動(dòng)、暴躁、叫聲嘶啞、小便色黃、大便干結(jié)量少，處于機(jī)能亢進(jìn)狀態(tài)。胃火熾盛則耗傷津液，大鼠出現(xiàn)口渴多飲、叫聲嘶啞、小便色黃和大便秘結(jié)；胃火上炎，血得熱則行，毛細(xì)血管充血，可見大鼠唇、舌、趾、爪和耳顏色偏紅。因此胃熱證候下大鼠出現(xiàn)多種熱證反應(yīng)。而經(jīng)麥粒灸干預(yù)后，大鼠毛發(fā)發(fā)黃，唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅以及喜動(dòng)、暴躁、叫聲嘶啞、小便色黃和大便干結(jié)量少等胃熱表現(xiàn)的證候特征均得到緩解。研究結(jié)果證明胃熱證大鼠出現(xiàn)胃黏膜損傷[2]，本實(shí)驗(yàn)中組織病理學(xué)也進(jìn)一步驗(yàn)證此觀點(diǎn)，經(jīng)麥粒灸干預(yù)后胃黏膜各層結(jié)構(gòu)趨向完整，炎癥細(xì)胞減少，未見明顯出血點(diǎn)或出血灶形成，在組織病理學(xué)層面驗(yàn)證麥粒灸對(duì)胃熱證大鼠胃黏膜損傷具有修復(fù)作用。但作用機(jī)理并不可知。因此針對(duì)胃黏膜組織屏障保護(hù)功能，借助QT-PCR技術(shù)，對(duì)胃黏膜組織中的TFF2、TNF-α進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常組比較，胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2 mRNA表達(dá)量和血清中TFF2含量顯著下降，胃黏膜中TNF-α mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，而艾灸胃經(jīng)穴則可以上調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2 mRNA的表達(dá)量和血清中TFF2含量，下調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TNF-α mRNA的表達(dá)量。說明艾灸胃經(jīng)穴促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)的作用可能與上調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2的水平相關(guān)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)一般行為學(xué)觀察、組織病理學(xué)以及胃黏膜屏障保護(hù)因子檢測(cè)，認(rèn)為胃熱證證候下胃黏膜屏障會(huì)受到破壞，炎癥細(xì)胞浸潤，麥粒灸可調(diào)節(jié)大鼠胃熱證不適癥狀，改善胃黏膜破損，提高胃黏膜屏障保護(hù)因子水平，從而促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)，熱證可灸具有可行性。