謝宇鋒，余云進(jìn)，楊錦蘭，陳 赟，馮 軍△，楊宗保

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518034； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；3.廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361005)

胃熱證主要表現(xiàn)為胃火熾盛、胃脘灼痛等實(shí)熱癥狀，是熱證中的典型病證。動物實(shí)驗(yàn)研究表明，胃熱證大鼠的胃黏膜組織出現(xiàn)損傷、炎性病變等病理學(xué)改變[1-2]，故胃熱證與胃黏膜損傷的相關(guān)病變具有一致性。灸法作為中醫(yī)的特色療法，具有適應(yīng)癥廣泛、便于使用的特點(diǎn)。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灸法對胃黏膜損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用[3-4]。古往今來，雖然灸法用于治療熱證的理論探討和實(shí)踐諸多，但因其相關(guān)的實(shí)驗(yàn)開展較少，具體的作用機(jī)制尚未揭示。

胃黏膜屏障對胃黏膜損傷具有防御作用，其防御機(jī)制由黏液-碳酸氫鹽屏障、黏膜屏障等相互協(xié)調(diào)而成[5]。三葉因子2(Trefoil Factor Family 2，TFF2)是胃黏膜的重要保護(hù)因子，一定程度上反應(yīng)了胃黏膜屏障的防御功能。據(jù)此，本研究擬通過研究麥粒灸對胃熱證胃黏膜損傷大鼠胃黏膜屏障的影響，以闡釋麥粒灸對胃黏膜保護(hù)作用的機(jī)制及“熱證可灸”理論的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量(150±20)g，購買自上海斯萊克動物實(shí)驗(yàn)有限責(zé)任公司[許可證號：SCXK(滬)2017-0005]，飼養(yǎng)于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，適應(yīng)環(huán)境7 d后開始實(shí)驗(yàn)，室溫控制在20～22℃，相對濕度65%～70%,自然光明暗周期，自由飲食。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 勻漿機(jī)(德國IKA公司,型號：IKA T10 basic)；高速低溫離心機(jī)(SCILOGBX，型號D3024R)；低速離心機(jī)(SCILOGBX，型號：S1010E);基因擴(kuò)增儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司，型號：ETC811)；超微量分光光度計(jì)(NannoVue，型號：NanoVue Plus)；熒光定量PCR儀(天隆科技,型號：Gentier96E)；GloMax酶標(biāo)儀(Promega，型號：GM3030)；病理切片機(jī)(Leica,型號:CM1850)；智能生物顯微鏡(奧林巴斯Olympus公司，型號:BX53)。

1.2.2 試劑 辣椒粉(泰州春和源食品有限公司，許可證號：SC10332128102093)；無水乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20190213)；TFF2 ELISA試劑盒(Elabscience科技生物公司，貨號：R1873)；RNA提取試劑盒(艾德萊生物技術(shù)有限公司，貨號：RN03)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO，貨號：FSQ-101)；無毒性核酸染色劑[生物工程(上海)股份有限公司，貨號：EA26BA0029]。

1.3 造模與分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、麥粒灸組。胃熱證胃黏膜損傷模型制備：參照ZOU Z J等[6]方法進(jìn)行造模。將80 g辣椒干粉混入1 L的純水中，經(jīng)120目篩過濾后制成辣椒混懸液(80 mg/mL)。模型組大鼠、麥粒灸組大鼠灌胃辣椒混懸液(10 mL/kg)，每天經(jīng)口灌胃2次，連續(xù)6 d，第6天灌胃結(jié)束后，大鼠禁食不禁水12 h，于第7天灌胃無水乙醇(1 mL)1次。結(jié)束后3 h大鼠恢復(fù)自由飲食。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 選穴方法 根據(jù)課題組前期研究艾灸干預(yù)胃熱證胃黏膜損傷機(jī)制，麥粒灸組治療選用足陽明胃經(jīng)梁門、足三里為治療穴位[7]，參照李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8]對大鼠的穴位定位。大鼠梁門穴位于腹部正中線與乳頭之間連線的中點(diǎn)，臍上約20 mm；大鼠足三里穴位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處。將所選穴位穴區(qū)使用脫毛膏脫毛、并用濕棉簽將鼠毛擦拭干凈，隨后對穴區(qū)使用苦味酸進(jìn)行標(biāo)記。

1.4.2 艾灸方法 造模結(jié)束后第2天開始治療。將所有麥粒灸組大鼠仰臥朝上用鼠板固定，用鑷子放置麥粒于穴位上(將1 mg純艾絨捏制為基底部2.5～3.0 mm、高度4～5 mm的麥粒)，線香點(diǎn)燃，每個穴位共灸7個麥粒，每個麥粒的燃燒時間為10～12 s，期間用紅外線測溫儀監(jiān)測施灸部溫度，溫度控制45～48℃。麥粒灸1次/d,共7 d。正常組和模型組大鼠同樣捆綁固定，不做麥粒灸治療。

1.5 樣本采集

所有組別大鼠于第7天麥粒灸治療結(jié)束后禁食不禁水，12 h后，經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，用手術(shù)器械剖開大鼠腹部，充分暴露腹主動脈并取血5 mL,血漿于常溫靜置1 h后,離心5 min(轉(zhuǎn)速3 000 r/min),離心后用取使用移液槍將血清吸取,移置于凍存管，并放入-80℃冰箱保存，備用于ELISA檢測。用手術(shù)剪將大鼠全胃取出分離，沿胃大彎剪開，在生理鹽水中洗凈，隨后充分展開胃黏膜，觀察胃黏膜情況，將胃黏膜組織分成2份，一份放入10%多聚甲醛中固定24～48 h，包埋、切片、染色。另一份胃黏膜組織迅速置入液氮冷凍保存，1 h后移入-80℃冰箱，用于QT-PCR檢測。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠一般行為學(xué)觀察 ①外觀：唇、舌、趾、爪、耳、毛發(fā)顏色;②精神活動狀態(tài)：精神狀態(tài)正常，喜靜，喜動，興奮，叫聲嘶啞或響亮;③大小便情況：小便色黃或色清，大便正常、秘結(jié)或稀溏。

1.6.2 胃黏膜組織病理學(xué)光鏡 胃黏膜組織在固定結(jié)束后進(jìn)行梯度酒精脫水、包埋、二甲苯透明、切片。隨后采用HE染色，在400倍光鏡下觀察胃黏膜組織病理形態(tài)并采集圖片。

1.6.3 實(shí)時熒光定量(QT-PCR)檢測胃黏膜組織TFF2、腫瘤壞死因子(TNF-α) 稱取約100 mg組織樣品，加液氮研磨，用1 mL trizol室溫裂解5 min，4℃ 12 000 rpm離心10 min；取上清，按常規(guī)方法提取總RNA，隨后進(jìn)行RNA濃度測定，取1 μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，總體系10 μL，制備cDNA模板。按照說明書進(jìn)行TFF2 mRNA、TNF-α mRNA的RT-PCR檢測，以β肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，引物序列見表1，用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)Ct值，將獲得目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值，得到△Ct值后，采用2-△△Ct方法[9]分析mRNA相對表達(dá)量。

表1 RT-PCR檢測引物信息表

1.6.4 血清TFF2含量檢測 ELISA測定血清TFF2含量。具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般行為學(xué)比較

正常組大鼠毛發(fā)光亮，外觀顏色正常，精神狀態(tài)好，大小便情況無異常;模型組大鼠的毛發(fā)發(fā)黃，唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅，喜動，暴躁，叫聲嘶啞，小便色黃，大便干結(jié)量少;麥粒灸組大鼠較模型組大鼠好轉(zhuǎn)，外觀顏色有所改善，大小便情況較正常。

2.2 各組大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)比較

正常組胃黏膜皺襞完整、結(jié)構(gòu)清晰、層次分明，未見損傷或脫落;模型組胃黏膜出現(xiàn)皺襞萎縮、上皮細(xì)胞脫落壞死，細(xì)胞間隙增寬，炎癥細(xì)胞浸潤;麥粒灸組胃黏膜皺襞破損有所恢復(fù)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及固有腺體基本正常，炎癥浸潤減輕。見圖1。

注：A、B、C分別為正常組、模型組、麥粒灸組。圖1 大鼠胃黏膜組織病理學(xué)結(jié)果(400×)

2.3 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)比較

相比正常組，模型組大鼠胃黏膜組織中的TFF2 mRNA含量表達(dá)降低(P<0.01)、TNF-α mRNA表達(dá)升高(P<0.01),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在麥粒灸組中TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)較模型組接近正常組(P<0.01或P<0.05)，結(jié)果顯示干預(yù)后含量得到有效逆轉(zhuǎn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2、圖2。

表2 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA和TNF-α mRNA的相對表達(dá)量

注：a為TFF2 mRNA,b為TNF-α mRNA。圖2 各組大鼠胃黏膜組織TFF2 mRNA、TNF-α mRNA表達(dá)量(n=8)

2.4 各組大鼠血清TFF2含量比較

相比正常組，模型組大鼠的血清TFF2含量表達(dá)降低，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；在麥粒灸組中的表達(dá)較模型組接近正常組，與模型組相比，麥粒灸組表達(dá)量差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清TFF2含量變化

3 討論

灸法治療熱證屬于反佐治法，早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中便提出：“寒熱虛實(shí)，火當(dāng)自之”，《素問·六元正紀(jì)大論》云：“火郁發(fā)之”，均為“熱證可灸”奠定了理論基礎(chǔ)。歷代不少醫(yī)家對“熱證可灸”均付諸于實(shí)踐，如金元四大家之一的朱丹溪在針灸臨床中運(yùn)用“灸治實(shí)熱證”和“灸治虛熱證”[10]，《千金翼方》則記載：“胃中熱，灸三里三十壯?！笔埂盁嶙C可灸”得到佐證和發(fā)展。至現(xiàn)代研究則揭示，艾灸能從抗感染、體液代謝、中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平和免疫功能等調(diào)節(jié)作用于熱證[11]。麥粒灸是灸法的分支之一，是用麥粒狀大的艾柱直接灸的一種方法，具有灸量大、療效顯著的特點(diǎn)，相比傳統(tǒng)艾灸，麥粒灸溫?zé)嵋鸬淖仆锤袦p小、瘢痕形成相對少、適應(yīng)病癥廣泛、易于被患者所接受。在主治功能上，麥粒灸具有既能祛寒又可泄熱的雙向性特點(diǎn)[12]。本課題組早期的研究也表明，艾灸足陽明胃經(jīng)穴“梁門”“足三里”對胃熱證大鼠胃黏膜損傷的修復(fù)有促進(jìn)作用[7]，但灸法治療熱證的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，所以本研究以胃黏膜屏障為切入點(diǎn)，研究麥粒灸胃經(jīng)穴促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)的作用機(jī)制。

胃黏膜屏障主要包括胃黏液屏障和胃黏膜上皮屏障。而胃黏液屏障在胃黏膜屏障中起著核心的作用，既可以使胃黏膜上皮對胃內(nèi)容物產(chǎn)生機(jī)械損傷和防御作用，又可以抑制胃酸和胃蛋白酶，使胃黏膜上皮的被侵蝕減少。胃黏液屏障主要包括黏蛋白、水、電解質(zhì)、三葉肽(Trefoil factor family,TFFs)以及脂類，覆蓋于胃黏膜上皮細(xì)胞表面[13]。TFFs是胃黏液屏障的主要組成成分之一，包含了乳癌相關(guān)肽(pS2或TFF1)、解痙多肽(SP或TFF2)和腸三葉因子(ITF或TFF3)[14]。作為黏液層的一個主要組成成分，TFFs可以將胃黏液層中的另一個重要組成成分黏蛋白連接起來，使單獨(dú)的黏蛋白形成相互重疊、相互穿插的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使黏液凝膠層的結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，從而對胃黏膜產(chǎn)生保護(hù)作用[15]。Thim L等[16]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TFFs含量下降，會導(dǎo)致胃黏膜的黏蛋白結(jié)合形成的多聚體下降，胃黏液凝膠結(jié)構(gòu)變得松散、黏液層萎陷。因此，TFFs的含量可以作為反映胃黏液屏障功能的重要指標(biāo)。TFF2是三葉因子家族中的重要成員，主要分布在胃竇和十二指腸等消化性潰瘍易發(fā)部位。有研究表明，非甾體藥物誘導(dǎo)的潰瘍在TFF2基因敲除的小鼠中更為敏感[17]。相關(guān)研究表明，給予外源性的TFFs可以減輕NSAIDs、乙醇以及應(yīng)激導(dǎo)致的胃黏膜損傷，也可以促進(jìn)傷口愈合的速度[18-19]，在體內(nèi)出現(xiàn)損傷時，TFF2能通過細(xì)胞遷移以保護(hù)胃黏膜受損[20]。因此，TFFs不僅可以反映胃黏膜屏障的功能，而且是重要的胃黏膜保護(hù)因子。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃熱證證候下大鼠毛發(fā)發(fā)黃，唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅以及喜動、暴躁、叫聲嘶啞、小便色黃、大便干結(jié)量少，處于機(jī)能亢進(jìn)狀態(tài)。胃火熾盛則耗傷津液，大鼠出現(xiàn)口渴多飲、叫聲嘶啞、小便色黃和大便秘結(jié)；胃火上炎，血得熱則行，毛細(xì)血管充血，可見大鼠唇、舌、趾、爪和耳顏色偏紅。因此胃熱證候下大鼠出現(xiàn)多種熱證反應(yīng)。而經(jīng)麥粒灸干預(yù)后，大鼠毛發(fā)發(fā)黃，唇、舌、趾、爪、耳顏色偏紅以及喜動、暴躁、叫聲嘶啞、小便色黃和大便干結(jié)量少等胃熱表現(xiàn)的證候特征均得到緩解。研究結(jié)果證明胃熱證大鼠出現(xiàn)胃黏膜損傷[2]，本實(shí)驗(yàn)中組織病理學(xué)也進(jìn)一步驗(yàn)證此觀點(diǎn)，經(jīng)麥粒灸干預(yù)后胃黏膜各層結(jié)構(gòu)趨向完整，炎癥細(xì)胞減少，未見明顯出血點(diǎn)或出血灶形成，在組織病理學(xué)層面驗(yàn)證麥粒灸對胃熱證大鼠胃黏膜損傷具有修復(fù)作用。但作用機(jī)理并不可知。因此針對胃黏膜組織屏障保護(hù)功能，借助QT-PCR技術(shù)，對胃黏膜組織中的TFF2、TNF-α進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與正常組比較，胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2 mRNA表達(dá)量和血清中TFF2含量顯著下降，胃黏膜中TNF-α mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)，而艾灸胃經(jīng)穴則可以上調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2 mRNA的表達(dá)量和血清中TFF2含量，下調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TNF-α mRNA的表達(dá)量。說明艾灸胃經(jīng)穴促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)的作用可能與上調(diào)胃熱證大鼠胃黏膜中TFF2的水平相關(guān)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)一般行為學(xué)觀察、組織病理學(xué)以及胃黏膜屏障保護(hù)因子檢測，認(rèn)為胃熱證證候下胃黏膜屏障會受到破壞，炎癥細(xì)胞浸潤，麥粒灸可調(diào)節(jié)大鼠胃熱證不適癥狀，改善胃黏膜破損，提高胃黏膜屏障保護(hù)因子水平，從而促進(jìn)胃熱證大鼠胃黏膜損傷修復(fù)，熱證可灸具有可行性。