徐 菁,白玉琢,陳 莉,張 莉△,劉 通

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095)

腰痛是全球性的公共健康問題，每年近80%的成年人患有腰痛，發(fā)病率逐年升高，經(jīng)濟損失巨大，因而是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點[1]。多裂肌在內(nèi)的脊柱深層肌群在維持腰椎穩(wěn)定性中發(fā)揮核心作用[2]。已有研究證實，腰痛患者的多裂肌存在不同程度的損傷或退變[3-5]。因此，恢復(fù)腰多裂肌功能對于維持腰椎穩(wěn)定和治療腰痛有重要意義。針灸是治療腰痛的重要非藥物療法，臨床中首選委中穴[6]。本課題組前期研究證實，電針“委中”可從多個方面促進損傷腰多裂肌的再生修復(fù)[7-14]。鈣調(diào)蛋白(Calmodulin，CaM)在細胞內(nèi)與Ca2+結(jié)合后形成Ca2+/CaM復(fù)合物，激活下游的鈣調(diào)蛋白激酶CaMKⅡ，對機體細胞的功能活動進行調(diào)節(jié)。骨骼肌損傷后，Ca2+/CaM/CaMKⅡ通路激活并產(chǎn)生炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[15-18]。本研究選擇腰多裂肌損傷大鼠模型，以CaM/CaMKII/iNOS通路和海馬氧化應(yīng)激為切入點，旨在探討電針“委中”治療多裂肌損傷所致腰痛的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本研究購入北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的SPF級SD雄性大鼠40只，體質(zhì)量(280±20)g，許可證號：SCXK(京)2016-0006。大鼠分籠后飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院動物室，自由進食和飲水，12 h明暗交替周期，室溫(20±1)℃，濕度(50±10)%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。本研究已通過北京中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準，實驗過程中對動物的處理符合2006年度科技部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 主要試劑

布比卡因磷酸鹽溶液(美國Sigma公司，B5274-1G);大鼠CaM/CaMKII試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，M1003328-48T);大鼠iNOS試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，M1003127-48T);RIPA裂解液(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，WB-0071);BCA蛋白定量試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，BCA01);β-Actin(美國Santa公司，AC001-M);CaM蛋白(英國Abcam公司，ab45689);CaMKII(英國Abcam公司，ab22609);iNOS(英國Abcam公司，ab15323);MDA試劑盒(南京建成生物科技有限公司，A003-1);SOD試劑盒(南京建成生物科技有限公司，A001-3)。

1.3 主要儀器

酶標儀(美國Thermo Scientific公司，Multiskan MK3);自動洗板機(北京拓普分析儀器有限公司，DEM-3);電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，SKP-02.600);離心機(美國Sigma公司，3K18);分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司，UV-2100);恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司，HW·SY11-K);韓式電針儀(南京濟生醫(yī)療科技有限公司，HANS-200A);華佗牌一次性針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，0.30 mm×13 mm)。

1.4 動物分組及造模方法

SD大鼠隨機分為空白組、模型1 d組和模型3 d組、電針1 d組和電針3 d組,每組各8只。

采用雙側(cè)L4～5水平多裂肌注射0.5%布比卡因溶液復(fù)制腰多裂肌損傷大鼠模型。針頭貼L4～5棘突骨面刺入注射部位，雙側(cè)共4個注射點，每點注射100 μL，注射時間≥3 s，以利于藥物的吸收，注射結(jié)束后完成造模。

1.5 針刺方法

造模結(jié)束后，將大鼠俯臥位固定，電針雙側(cè)“委中”(“委中”定位參照李忠仁主編的《實驗針灸學(xué)》中的常用實驗動物穴位圖譜)。刺激參數(shù)：疎密波(疏波2 Hz，密波100 Hz)，電流強度(1 mA)，留針20 min，每日1次?？瞻捉M和模型組不做任何治療。電針1 d組和電針3 d組，在取穴和刺激參數(shù)上相同，只是干預(yù)時間有差別，電針1 d組為電針干預(yù)1 d后取材，電針3 d組為電針干預(yù)3 d后取材。

1.6 動物取材

各組大鼠在治療1 d、3 d后同步取材。使用10%水合氯醛(350 mg/kg,iP)麻醉后斷頭處死，無菌條件下冰盤上迅速分離取出大鼠海馬組織，液氮中保存待測。

1.7 觀察指標及方法

1.7.1 各組大鼠海馬組織中CaM、CaMKII、iNOS的含量 使用ELISA法檢測海馬組織中CaM、CaMKII、iNOS的含量：①將標準品6 000～10 000 r/min離心30 s后倍比稀釋；②將標準品和樣品溶液等量加入標記好的孔板中，混勻后37℃溫育0.5 h；③每孔依次加入等量的酶標試劑后37℃溫育0.5 h；④每孔依次加入等量的底物溶液后，37℃避光顯色10 min；⑤加入等量的終止液終止反應(yīng)5 min后，使用酶標儀依序測量各孔的光密度(OD值)；⑥使用軟件“CurveExPert1.3”分析數(shù)據(jù)，計算樣品CaM、CaMKII、iNOS的含量。

1.7.2 各組大鼠海馬組織中CaM、CaMKII、iNOS的蛋白表達 Western blot法檢測海馬組織中CaM、CaMKII、iNOS的蛋白表達。

1.7.2.1 蛋白提取 將海馬組織研碎后加入PBS漂洗，然后加入預(yù)冷的RIPA裂解液冰上裂解30 min后超聲粉碎，12 000 r/min 4℃離心10 min，吸取上清蛋白液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2.2 蛋白定量 根據(jù)BCA法依次加入所需濃度的BCA試劑的A、B工作液，振蕩混勻后，37℃下放置30 min，測定OD值。

1.7.2.3 制膠 根據(jù)樣品所需濃度，配制分離膠后灌膠，待其充分聚合。

1.7.2.4 蛋白電泳 樣品中分別加入等體積的上樣緩沖液混勻后煮沸10 min后電泳，電泳后膠片室溫搖床上染色至膠面出現(xiàn)明顯的藍色蛋白條帶。

1.7.2.5 轉(zhuǎn)膜 根據(jù)樣品蛋白濃度進行80 V恒定電壓的SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜。

1.7.2.6 封閉及雜交 加入一抗溶液，室溫下?lián)u床孵育3 h后TBST洗膜，加入二抗溶液，室溫搖床孵育2 h后TBST洗膜。

1.7.2.7 曝光鑒定 曝光、顯影、掃描后使用Quantity One軟件分析目標條帶的光密度值，計算樣品CaM、CaMKII、iNOS的蛋白相對表達量。

1.7.3 各組大鼠海馬組織中MDA濃度和SOD活性 生物化學(xué)法檢測各組大鼠海馬組織中MDA濃度和SOD活性。

1.7.3.1 MDA濃度檢測 ①依照試劑盒配制標準品和試劑，4℃冷藏保存；②依序加入標準品、試劑和待測樣品后充分混勻；③95℃水浴鍋開蓋煮沸試劑40 min；④流動水冷卻試劑后，3 500～4 000 r/min離心10 min，提取上清液，根據(jù)吸光度值計算樣品MDA濃度。

1.7.3.2 SOD活性檢測 ①依照試劑盒配置所需試劑(緩沖液、底物貯備液、酶貯備液、酶稀釋液)，2～8℃保存；②依序在孔板中加入試劑和樣品，充分混勻；③各孔溶液37℃孵育20 min，根據(jù)吸光度值計算樣品SOD活性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬組織中CaM、CaMKII、iNOS含量比較

表1示，與空白組比較，模型1 d組和模型3 d組海馬CaM、CaMKII含量顯著升高(P<0.01), iNOS含量升高(P<0.01或P<0.05)；與模型1 d組比較，電針1 d組海馬的CaM含量降低(P<0.05), iNOS、CaMKII含量顯著降低(P<0.01)；與模型3 d組比較，電針3 d組海馬的CaM含量顯著降低(P<0.01), CaMKII、iNOS含量降低(P<0.05)；與電針1 d組比較，電針3 d組海馬的CaM、CaMKII含量顯著降低(P<0.01)，iNOS含量雖有降低但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠海馬CaM、CaMKII、iNOS含量比較

2.2 各組大鼠海馬組織中CaM、CaMKII、iNOS蛋白表達量比較

表2示，與空白組比較，模型1 d組和模型3 d組海馬的CaM、CaMKII、iNOS蛋白表達量顯著升高(P<0.01)；與模型1 d組比較，電針1 d組海馬的CaM、iNOS蛋白表達量變化明顯(P<0.01)，CaMKII蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型3 d組比較，電針3 d組海馬的CaM蛋白表達量顯著變化(P<0.01)，CaMKII蛋白表達量降低(P<0.05)，iNOS蛋白蛋白表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與電針1 d組比較，電針3 d組海馬的CaM、CaMKII蛋白表達量升高(P<0.05), iNOS蛋白表達量降低(P<0.05)。見圖1。

表2 各組大鼠海馬CaM、CaMKII、iNOS蛋白表達量比較

2.3 各組大鼠海馬組織中MDA濃度和SOD活性比較

表3示，與空白組比較，模型1 d組和模型3 d組海馬的MDA濃度顯著升高(P<0.01), 模型1 d組海馬的SOD活性顯著降低(P<0.01), 模型3 d組海馬的SOD活性升高(P<0.05)；與模型1 d組比較，電針1 d組海馬的MDA濃度顯著降低，SOD活性顯著升高(P<0.01)；與模型3 d組比較，電針3 d組海馬的MDA濃度顯著降低(P<0.01)，SOD活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與電針1 d組比較，電針3 d組海馬的MDA濃度和SOD活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠海馬MDA濃度和SOD活性比較

3 討論

機體損傷不只局限于組織局部，中樞神經(jīng)系統(tǒng)也會做出反應(yīng)。骨骼肌損傷后，首先引起損傷局部肌纖維的病變和炎癥反應(yīng)。隨著骨骼肌損傷的加重，炎癥范圍擴大，局部蓄積的炎性細胞因子、組織胺等有害物質(zhì)會形成傷害性刺激信號，通過神經(jīng)通路逐級向上傳遞。海馬組織是接受、處理傷害信號的一個高級中樞，參與骨骼肌損傷后的炎癥反應(yīng)的中樞調(diào)控。因而，多裂肌損傷后海馬組織的病理改變是研究布比卡因引起的多裂肌損傷所致的腰痛發(fā)病機制的一個重要思路。機體損傷后細胞內(nèi)外環(huán)境中Ca2+的變化在一定程度上反應(yīng)了機體損傷的程度。因此，Ca2+/CaM/CaMKII信號通路的變化可能是多裂肌損傷后評估海馬組織損傷狀態(tài)的指標。組織細胞損傷后產(chǎn)生氧化應(yīng)激病理反應(yīng)，MDA和SOD作為反應(yīng)組織細胞抗氧化能力的經(jīng)典指標，用來評估海馬組織損傷的程度。在腰多裂肌損傷所致的腰痛模型中，筆者以傷害性刺激信號傳遞的高級中樞-海馬組織為立足點，結(jié)合Ca2+/CaM/CaMKII信號通路，觀察海馬組織抗氧化能力的變化，以揭示多裂肌損傷型腰痛的發(fā)病機制以及電針“委中”的治療效應(yīng)，擬從新的角度闡釋電針“委中”治療腰痛的效應(yīng)機制。

骨骼肌損傷后，肌纖維大量變性壞死，肌細胞內(nèi)的Ca2+濃度急劇升高，Ca2+與CaM特異性的結(jié)合后促進了單核巨噬細胞、淋巴細胞等功能，加重了肌纖維的損傷，在骨骼肌的急性炎癥反應(yīng)中，Ca2+/CaM信號通路發(fā)揮了重要作用[19]。CaMKII作為Ca2+/CaM信號通路的下游信號分子，主要傳遞骨骼肌損傷后的炎癥信號。CaM和CaMKII在海馬皮質(zhì)等腦組織中含量比較豐富。生理條件下，CaM和CaMKII可以調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)元的代謝、突觸連接和神經(jīng)遞質(zhì)合成等活動。病理條件下，神經(jīng)元的鈣超載可以激活CaM和CaMKII。而過度激活的CaM和CaMKII反過來又加重鈣超載和神經(jīng)元的損傷[20]。過度激活的CaM和CaMKII不僅引起細胞的凋亡[21]，同時引起細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)物的代謝失衡，產(chǎn)生大量的自由基，引起細胞的氧化應(yīng)激損傷[22]。NO是一種重要的炎性介質(zhì)，也是Ca2+/CaM/CaMKII信號通路的重要下游信號分子，組織損傷后通過巨噬細胞分泌，可以引起細胞的氧化應(yīng)激損傷，在神經(jīng)組織中主要由iNOS誘導(dǎo)后產(chǎn)生[23]，iNOS的變化可以反映海馬NO的狀態(tài)，間接反映海馬組織的氧化應(yīng)激損傷程度。

MDA是細胞發(fā)生氧化反應(yīng)后生成的細胞毒性物質(zhì)，MDA濃度是反應(yīng)細胞氧化應(yīng)激損傷程度的重要標志物。SOD是細胞內(nèi)重要的抗氧化酶，SOD活性的強弱直接反映了機體的抗氧化能力[24-28]。本研究通過觀察腰多裂肌損傷后大鼠海馬組織CaM/CaMKII/iNOS通路內(nèi)CaM、CaMKII、iNOS含量和蛋白表達的變化以及MDA濃度和SOD活性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠腰多裂肌損傷后海馬組織存在CaM/CaMKII/iNOS通路的激活和海馬組織抗氧化損傷的能力降低，二者存在相同的趨勢。由此說明大鼠腰多裂肌損傷后，CaM/CaMKII/iNOS通路激活可能是引起海馬氧化應(yīng)激損傷的1個原因。

委中穴是足太陽膀胱經(jīng)的下合穴，臨床中廣泛應(yīng)用于治療下腰痛。委中穴是四總穴之一，主治區(qū)域集中于腰背部。所在經(jīng)脈——足太陽膀胱經(jīng)循行經(jīng)過整個后背和腰，腰為腎之府，膀胱和腎互為表里。委中穴位于腘窩正中，這一區(qū)域分布有腘靜脈(最終匯入下腔靜脈)，腘動脈(起于腹主動脈及其分支)，股后皮神經(jīng)和腓腸肌內(nèi)側(cè)皮神經(jīng)(屬于骶叢的分支)，這些都和腰背部以及L4～5直接或間接聯(lián)系，為委中穴治療腰背部疾病提供了依據(jù)[24]。團隊前期通過大量研究證實了電針“委中”治療大鼠腰多裂肌損傷的科學(xué)性。本研究成功復(fù)制了L4～5多裂肌損傷的大鼠模型，本次研究發(fā)現(xiàn)，造模后海馬組織中CaM、CaMKⅡ、iNOS的含量和蛋白相對表達量存在上升趨勢，海馬組織的抗氧化能力降低。電針“委中”治療后，海馬組織中CaM、CaMKⅡ、iNOS的含量和蛋白相對表達量降低，海馬組織的抗氧化能力提高。一定程度上說明，大鼠L4～5節(jié)段多裂肌損傷后，海馬組織存在CaM/CaMKⅡ/iNOS信號通路的激活和氧化應(yīng)激損傷，海馬組織的氧化應(yīng)激損傷可能和大鼠腰多裂肌損傷后CaM/CaMKⅡ/iNOS信號通路的過度激活有關(guān)。電針“委中”治療可以抑制CaM/CaMKⅡ/iNOS信號通路的過度激活，提高海馬的抗氧化能力，這可能是電針“委中”治療腰多裂肌損傷所致腰痛的部分機制。然而，關(guān)于L4～5多裂肌損傷后通過何途徑引起海馬組織CaM/CaMKⅡ/iNOS信號通路的激活和氧化應(yīng)激損傷，電針“委中”怎樣對這一過程調(diào)節(jié)，需要今后通過進一步研究來闡釋。