姜凡，張迪，尹洪娜，吳建麗，魏慶雙，孫忠人

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

術(shù)后腸麻痹(postoperativeileus,POI)是指發(fā)生在腹部或非腹部手術(shù)后出現(xiàn)的頑固性便秘和經(jīng)口攝食不耐受，主要由破壞胃腸道正常協(xié)調(diào)推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的非機(jī)械性因素所導(dǎo)致，是一種術(shù)后常見(jiàn)的良性、自限性過(guò)程[1]。臨床以腹脹、惡心、嘔吐、不能排便或不能耐受固體飲食為突出表現(xiàn),極大地增大了醫(yī)療成本。

雖然已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道電針對(duì)POI療效顯著，然而其取效機(jī)制至今尚未明晰，亟需進(jìn)一步深入研究[2]。RNA-seq技術(shù)作為多種組學(xué)技術(shù)中應(yīng)用范圍最廣的高通量測(cè)序技術(shù)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于疾病發(fā)生機(jī)制和干預(yù)措施靶點(diǎn)的篩選中[3-5]。本研究利用RNA-seq技術(shù)對(duì)術(shù)后腸麻痹小鼠小腸組織進(jìn)行高通量測(cè)序，使用生物信息學(xué)工具篩選差異表達(dá)基因，以及基于差異表達(dá)基因的功能和信號(hào)通路富集分析，進(jìn)一步闡明電針治療術(shù)后腸麻痹的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選取C57BL/6N小鼠18只，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001，體質(zhì)量24～26 g，雄性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，室溫(25±3)℃，濕度(55±5)%，保持12 h光照，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食、自由飲水。

1.2 關(guān)鍵試劑和儀器

異氟烷和小動(dòng)物氣體吸入式麻醉機(jī)(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；色素(廣州晨曦食品有限公司)；智能恒溫加熱墊(深圳興鴻昌電器有限公司)；韓氏神經(jīng)穴位刺激儀(HANS-100A)(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組和小鼠POI模型構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食12 h禁水6 h，根據(jù)Kalff、Vilz[6-7]的方法誘導(dǎo)POI模型。隨機(jī)分為假手術(shù)組(SS)、模型組(IM)、電針組(EA)，每組6只。

1)模型組：異氟烷對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行麻醉后，使用眼科剪沿腹中線剪開(kāi)皮層和肌層，使用濕棉簽和自制工具，將盲腸輕微取出置于已被溫水浸泡過(guò)的濕紗布3點(diǎn)鐘方向上，將小腸沿逆時(shí)針?lè)较蜻M(jìn)行扇形展開(kāi)，使用自制工具沿十二指腸-空腸-回腸-回盲部的順序，進(jìn)行正向腸道標(biāo)準(zhǔn)操作，后進(jìn)行逆向腸道標(biāo)準(zhǔn)操作，并重復(fù)一次正向腸道標(biāo)準(zhǔn)操作，共計(jì)3次操作，每次5 min，共15 min。腸道操作結(jié)束后，按腸道取出的逆向順序回納入腹腔，使用不可吸收縫合線進(jìn)行雙層縫合。

2)電針組：在造模后2 h，電針刺激雙側(cè)足三里，直刺，針刺深度為5 mm，連接HANS-100A型電針儀，1 mA，電針參數(shù)：2/15 Hz，交替進(jìn)行，共20 min。

3)假手術(shù)組：僅開(kāi)腹后用溫?zé)釢窦啿几采w于腹腔部15 min，不對(duì)其進(jìn)行腸道操作。

1.3.2 樣品采集和測(cè)序

每組隨機(jī)選取3只進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)實(shí)驗(yàn)，取小腸中點(diǎn)，左側(cè)3 cm，右側(cè)3 cm，共6 cm，先用2管5 mL生理鹽水進(jìn)行沖洗，沖洗干凈后，再用1管5 mL RNAase-free水進(jìn)行沖洗，濾紙吸干，放于凍存管中，迅速投入液氮中。

進(jìn)行Total RNA樣品檢測(cè)，去除掉rRNA，對(duì)mRNA進(jìn)行富集，緊接著反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，加dNTP合成cDNA第二條鏈，合成的雙鏈cDNA經(jīng)純化、末端修復(fù)、加A、連接測(cè)序接頭處理后，用USER酶降解含有U的cDNA第二鏈并進(jìn)行PCR富集，最后用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的鏈特異性文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，上機(jī)進(jìn)行雙端測(cè)序，對(duì)raw reads進(jìn)行質(zhì)控，所有樣品質(zhì)控完成后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

測(cè)序數(shù)據(jù)后期分析所有數(shù)據(jù)均采用R語(yǔ)言和Excel軟件進(jìn)行整理分析，在數(shù)據(jù)歸一化處理過(guò)程中，采用log2，-log10等對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換方式使數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因

差異基因的篩選條件是P<0.05，F(xiàn)old Change<0.6或>1.7。IM組與SS組相比，腸道操作處理在小鼠小腸顯著上調(diào)基因161個(gè)，顯著下調(diào)基因327個(gè)；EA組與IM組相比，電針處理在小鼠小腸顯著上調(diào)基因25個(gè)，顯著下調(diào)基因242個(gè)。見(jiàn)圖1。

在小腸組織樣本中，IM組vs SS組和EA組vs IM組在按照設(shè)定閾值標(biāo)準(zhǔn)比較后，對(duì)差異基因表達(dá)結(jié)果繪制火山圖進(jìn)行直觀展示，見(jiàn)圖2、圖3。從圖中可知，腸道操作和電針處理均可使小鼠小腸組織內(nèi)基因表達(dá)發(fā)生顯著變化。

圖1 小腸差異基因個(gè)數(shù)分析

圖2 模型組vs假手術(shù)組差異基因火山圖

圖3 電針組vs模型組差異基因火山圖

2.2 差異表達(dá)基因GO注釋和KEGG通路富集分析

在獲取到IM組vs SS組和EA組vs IM組的差異基因列表后，使用DAVID[8-9]工具分別對(duì)兩組差異基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，設(shè)定P<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

圖4展示了IM組vs SS組差異基因在四種功能注釋(生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能、KEGG信號(hào)通路)分類(lèi)中各自最顯著的10個(gè)條目。在生物過(guò)程組中，上調(diào)差異基因主要富集結(jié)果涉及炎癥反應(yīng)、防御響應(yīng)和對(duì)外部刺激反應(yīng)過(guò)程；下調(diào)差異基因主要富集在一元羧酸代謝過(guò)程、外源代謝過(guò)程、細(xì)胞對(duì)外源刺激的反應(yīng)。在細(xì)胞成分組中，上調(diào)差異基因主要富集在細(xì)胞外空間、胞外區(qū)域；下調(diào)差異基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、肌原纖維、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)。在分子功能組中，上調(diào)差異基因主要富集在細(xì)胞因子活性、受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合；下調(diào)基因主要富集在單加氧酶活性、氧化還原酶活性、類(lèi)固醇羥化酶活性。在KEGG信號(hào)通路富集分析中，上調(diào)差異基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、腫瘤壞死因子信號(hào)通路；下調(diào)差異基因主要富集在藥物代謝-細(xì)胞色素P450、細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝、類(lèi)固醇激素生物合成、視黃醇代謝。

圖5展示了EA組 vs IM組差異基因在四種功能注釋(生物過(guò)程、細(xì)胞成分、分子功能、KEGG信號(hào)通路)分類(lèi)中各自最顯著的10個(gè)條目。在生物過(guò)程組中，上調(diào)差異基因主要富集結(jié)果涉及對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的響應(yīng)、肝臟發(fā)育和肝膽管系統(tǒng)開(kāi)發(fā)；下調(diào)差異基因主要富集在炎癥反應(yīng)、防御響應(yīng)及免疫應(yīng)答。在細(xì)胞成分組中，上調(diào)差異基因主要富集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；下調(diào)差異基因主要富集在細(xì)胞外空間、胞外區(qū)域。在分子功能組中，上調(diào)差異基因主要富集在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、類(lèi)固醇羥化酶活性；下調(diào)基因主要富集在受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合。在KEGG信號(hào)通路富集分析中，上調(diào)差異基因主要富集在細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝、藥物代謝-細(xì)胞色素P450、類(lèi)固醇激素生物合成、視黃醇代謝信號(hào)通路；下調(diào)差異基因主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用、腫瘤壞死因子信號(hào)通路。

圖4 模型組vs假手術(shù)組差異基因的功能富集分析

圖5 電針組vs模型組差異基因的功能富集分析

3 討論

針灸是一種有效的治療術(shù)后惡心、嘔吐和各種功能性胃腸疾病的治療方法[10-11]，在針灸專(zhuān)著中亦有“肚腹三里留”的記載，諸多研究也表明，足三里是干預(yù)POI的常見(jiàn)穴位。電針足三里已被證明可以加速結(jié)腸運(yùn)輸,并通過(guò)在清醒大鼠副交感、膽堿能途徑刺激遠(yuǎn)端結(jié)腸動(dòng)力[12-13]。一項(xiàng)對(duì)39名患者的隨機(jī)研究中，針灸組(足三里、三陰交)在腹部手術(shù)后首次排泄的時(shí)間明顯快于對(duì)照組[14]。因此，本研究選取足三里穴作為干預(yù)穴位。動(dòng)物研究模型對(duì)研究POI病理的復(fù)雜分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至關(guān)重要。筆者通過(guò)文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6系小鼠對(duì)外科手術(shù)在胃腸道傳輸中表現(xiàn)出更嚴(yán)重的延遲[15]，故本研究以該系小鼠為研究對(duì)象，成功復(fù)制了Kalff及其團(tuán)隊(duì)對(duì)POI研究的模型方案，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)擠壓腸道的棉棒工具進(jìn)行了改良，使其腸道擠壓時(shí)壓力可以保持較為恒定，為本研究數(shù)據(jù)分析的穩(wěn)健性奠定了基礎(chǔ)。

生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,SS組、IM組、EA組組間具有顯著不同的基因表達(dá)模式，這說(shuō)明小鼠經(jīng)電針處理后在基因表達(dá)模式上產(chǎn)生了顯著變化，這些炎癥相關(guān)的差異表達(dá)基因可能是電針對(duì)POI小鼠起效的特異性潛在靶點(diǎn)。

模型組vs假手術(shù)組共篩選得到488個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中161個(gè)基因在模型組中表達(dá)水平顯著上調(diào)，327個(gè)基因在模型組中表達(dá)水平顯著下調(diào)；電針組vs模型組共篩選得到267個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中25個(gè)基因在電針組中表達(dá)水平顯著上調(diào)，242個(gè)基因在電針組中表達(dá)水平顯著下調(diào)。通過(guò)進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)在模型組對(duì)比假手術(shù)組中，最顯著上調(diào)的基因?yàn)锳damts4、Hmox1、Ccl7、Arg1、Mmp3、Tm4sf20，最顯著下調(diào)的基因?yàn)門(mén)ppp、Lgals3、Pcp4l1、Pkhd1l1、Rfx2、Myl9、Kyat1；在電針組對(duì)比模型組中，最顯著上調(diào)的基因?yàn)锳kr1c19、Gsta1、Ugt2b5、Nat8f6，最顯著下調(diào)的基因?yàn)锳damts4、Hmox1、Cd14、ll1rn、Clec4e、Slc7a11、Nfil3、Nfkbia。GO富集分析結(jié)果表明，電針可能是通過(guò)對(duì)炎癥反應(yīng)、防御響應(yīng)和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)從而達(dá)到對(duì)術(shù)后腸麻痹的治療作用。KEGG信號(hào)通路富集分析表明，經(jīng)電針處理后主要涉及細(xì)胞因子相互作用、腫瘤壞死因子、趨化因子、神經(jīng)活性配體與受體的相互作用等方面的變化，表明電針通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)模式的變化進(jìn)而引起神經(jīng)傳導(dǎo)和細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的改變。通過(guò)以上分析，結(jié)合電針治療術(shù)后腸麻痹的研究現(xiàn)狀篩選得到可能與研究方向相關(guān)的3條通路：細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體互作通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、神經(jīng)活性配體與受體互作通路。

綜上所述，電針可能是通過(guò)改變細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞遷移、炎癥反應(yīng)、趨化因子受體結(jié)合、趨化因子活性改變了術(shù)后腸麻痹小鼠腸內(nèi)的炎癥水平和局部微環(huán)境，從而恢復(fù)腸道轉(zhuǎn)運(yùn)功能。