沙宗閣，楊欣，楊長福，黃高，鄭子安，劉楊，任勇

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，已成為腫瘤相關(guān)病死率最高的惡性腫瘤[1]。肺癌最主要的病理類型為腺癌、鱗癌和小細(xì)胞癌,根據(jù)組織學(xué)特性臨床中將肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)以及小細(xì)胞肺癌(SCLC)兩大類型。其中NSCLC可分為腺癌、鱗狀細(xì)胞癌以及大細(xì)胞癌[2]。SCLC由于其神經(jīng)內(nèi)分泌特性可以被清楚地鑒別出來，除形態(tài)學(xué)以及組織學(xué)以外，根據(jù)生長速度以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的難易程度特性又將小細(xì)胞肺癌分為局限性疾病以及廣泛性疾病。

斑蝥首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味辛，性熱，有大毒。歸肝、胃、腎經(jīng)。功可破血散結(jié)、攻毒蝕瘡[3-4]?，F(xiàn)代藥理研究報(bào)道，斑蝥具有抗癌活性，對(duì)惡性腫瘤尤其是晚期癌癥有較好的治療效果，如治療胃癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等[5-6]，但是其毒性限制了在臨床的廣泛應(yīng)用。斑蝥中有效抗癌成分是斑蝥素，其在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)機(jī)體沒有明顯的免疫抑制作用，這是抗癌藥物中突出的特點(diǎn)[7]，對(duì)肺癌、乳腺癌等有一定效果[8]。斑螯素可以抑制癌細(xì)胞中的DNA、RNA合成，通過干擾DNA的復(fù)制及mRNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程，進(jìn)而影響細(xì)胞的分裂與蛋白質(zhì)的合成，最終抑制癌細(xì)胞的生長、分裂[9-10]。為了進(jìn)一步探討斑蝥素在小細(xì)胞肺癌中的作用，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理方法，篩選化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)，對(duì)其靶點(diǎn)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，采用分子對(duì)接驗(yàn)證分析，進(jìn)一步明確斑蝥素抗小細(xì)胞肺癌的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

GeneMANIA (http://genemania.org/)；DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)；Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)；GeneCards(https://www.genecards.org/)。STRING (https://string-db.org/cgi/input.pl)；RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb )。

1.2 斑蝥素靶標(biāo)蛋白篩選

斑蝥素基于Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行靶點(diǎn)篩選，種屬選擇“人源”，其他參數(shù)默認(rèn)，篩選結(jié)果包括蛋白名稱、Uniprot ID等信息。

1.3 小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)篩選

基于GeneCards(https://www.genecards.org/) 和CTD(https://ctdbase.org/)數(shù)據(jù)庫篩選小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)，以“Small Cell Lung Carcinoma”為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選，選擇Relevance score≥25為小細(xì)胞肺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 相互作用分析

基于快速預(yù)測蛋白功能軟件GeneMANIA (http://genemania.org/)對(duì)24個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，該數(shù)據(jù)庫可基于共定位(co-localization)、共表達(dá)(co-expression)、物理相關(guān)性占(Physical Interactions)、預(yù)測(Predicted)、蛋白結(jié)構(gòu)域(Shated protein domains)、遺傳相關(guān)性(Genetic Interactions)等對(duì)基因集進(jìn)行分析和預(yù)測。輸入24個(gè)靶蛋白的Gene id的，種屬選擇“人源”，其他參數(shù)默認(rèn)。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

STRING(https://string-db.org/)結(jié)合Cytoscape通過degree 篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，選擇輸入方式是“Multiple proteins”，輸入小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)24個(gè)，種屬選擇“人源”，其他參數(shù)默認(rèn)[11]。點(diǎn)擊“Exports”選項(xiàng)，下載TSV格式的文件保存，導(dǎo)入Cytoscape軟件，選擇cytoHubba模塊，根據(jù)degree輸出前三個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)[12]。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證分析

斑蝥素與3個(gè)靶標(biāo)蛋白分子對(duì)接基于iGEMDOCK軟件，靶標(biāo)蛋白EGFR (PDBID:1M17)，PTGS2(PDBID:3W15)和(PDBID:4G8A)從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫RCSB PDB(http://www.rcsb.org/pdb)獲取3D晶體結(jié)構(gòu)[13]，分子對(duì)接相關(guān)參數(shù)參數(shù):解的個(gè)數(shù)(number of solution)2，子代 (Generation)70。群體大小(generic evolutionary method)200[13]。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)篩選

基于CTD和Genecards 數(shù)據(jù)庫篩選小細(xì)胞肺癌，選擇Relevance score≥25為關(guān)鍵靶點(diǎn)，基于CTD獲得1 788個(gè)小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)，基于Genecards獲得1 077個(gè)小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)，通過FunRich軟件取交集，共獲得小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)673個(gè)(圖1 A)。通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫篩選出斑蝥素化學(xué)成分靶點(diǎn)100個(gè)(圖1B)，采用FunRich 取交集篩選出24個(gè)靶點(diǎn)(圖1B)。斑蝥素-小細(xì)胞肺癌共有靶點(diǎn)見表1。

注:A:小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn);B:化學(xué)成分-小細(xì)胞肺癌共有靶點(diǎn)。圖1 化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)

表1 斑蝥素-小細(xì)胞肺癌共有靶點(diǎn)

2.2 靶點(diǎn)相互作用分析

24個(gè)靶點(diǎn)基于GeneMANIA分析靶蛋白的相互作用，其中共定位(co-localization)占0.98%、共表達(dá)(co-expression)占35.49%、物理相關(guān)性(Physical Interactions)占34.86%、預(yù)測(Predicted)占20.20%、蛋白結(jié)構(gòu)域(Shated protein domains)占4.65%、遺傳相關(guān)性(Genetic Interactions)占1.86%，見圖2。

圖2 GeneMANIA分析靶蛋白的相互作用

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)分析

基于STRING結(jié)合Cytoscape通過degree篩選，選擇degree大于12的為關(guān)鍵靶點(diǎn)，EGFR、PTGS2和TLR4為關(guān)鍵靶點(diǎn)，見圖3。

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2.4 iGEMDOCK分子對(duì)接結(jié)果

通過分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，結(jié)果以斑蝥素和EGFR、PTGS2、TLR4大分子匹配能量的大小決定結(jié)合的程度。如果匹配能量比較低，說明小分子和大分子結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定。斑蝥素與3個(gè)靶點(diǎn)有結(jié)合。其中作用最好的為PTGS2，見表2。

表2 斑蝥素與靶標(biāo)蛋白分子對(duì)接

3 討論

近年來隨著多學(xué)科的交叉，系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)的融合，對(duì)中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供創(chuàng)新思路。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，可以闡述機(jī)體與藥物相互作用的原理與規(guī)律，為中藥治療疾病的作用機(jī)制提供理論指導(dǎo)，目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被廣泛應(yīng)用于中藥研究[14]。已經(jīng)有研究表明[15],斑蝥素具有抗肺癌的作用，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選斑蝥素調(diào)節(jié)的靶標(biāo)蛋白，通過與小細(xì)胞肺癌靶點(diǎn)進(jìn)行整合，對(duì)靶標(biāo)蛋白進(jìn)行富集分析、關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選，通過分子對(duì)接對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證分析，進(jìn)一步探討其發(fā)揮防治小細(xì)胞肺癌的分子機(jī)制，從而為斑蝥素的應(yīng)用及開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

斑蝥素為中藥斑蝥中活性成分之一，為倍半萜類衍生物。斑蝥素藥理作用廣泛，具有較好的應(yīng)用前景，臨床已經(jīng)應(yīng)用斑蝥素注射液治療癌癥，而且具有較好的治療效果。本研究通過相互作用發(fā)現(xiàn),EGFR、PTGS2和TLR4為小細(xì)胞肺癌的核心靶點(diǎn)，通過分子對(duì)接驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)斑蝥素與PTGS2有結(jié)合，可能具有很好的相互作用。前列腺素內(nèi)過氧化物合酶(PTGS)包括組成型PTGS1和誘導(dǎo)型PTGS2，PTGS2又稱環(huán)氧合酶2(COX-2)[16]。在前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌等多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。結(jié)肺癌、直腸癌、食管癌、家族性腺瘤性息肉病組織中的PGE2水平升高，目前COX-2已成為抗癌藥物開發(fā)的新靶點(diǎn)[17-18]。Toll樣受體4(TLR4)在炎癥反應(yīng)信號(hào)發(fā)揮作用，為最早的Toll樣受體亞型之一，在單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、小腸上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等均有表達(dá)，多種疾病與TLR4具有相關(guān)性[19]；表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)突變或異常表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，EGFR在細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)及各種調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮作用，但是多種腫瘤中過度表達(dá)并失去控制，因此研究EGFR靶向藥已經(jīng)成為熱點(diǎn)[20]。已經(jīng)有研究表明斑蝥素在抗病毒、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫等功能，主要用于治療原發(fā)性肝癌，并對(duì)肺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等有一定的療效[21]。本研究的篩選為斑蝥素在小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用提供依據(jù)。