謝慧，陸敏，樊欣鈺

(1.南京中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210023； 2.南京中醫(yī)藥大學附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；3.南京市溧水區(qū)中醫(yī)院，江蘇 南京 211200；4.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院臨床學院，江蘇 南京 211200)

腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)是一種臨床上常見的胃腸功能紊亂性疾病，對患者的生活質(zhì)量往往有明顯的負面影響。有流行病學調(diào)查研究顯示其患病率為10%～20%[1]，且呈逐年上升的趨勢。目前臨床尚缺乏有效的治療藥物。近些年來，中醫(yī)藥在治療IBS-D方面取得了良好的效果，且未見明顯的毒副作用；益生菌被國際益生菌和益生元科學協(xié)會(ISAPP)推薦在IBS中使用，也具有“安全無毒”的特點。因此，臨床上采用中藥聯(lián)用益生菌的方法治療IBS-D日益增多，但其機制尚不明確。本研究將采用名老中醫(yī)驗方“腸康方”聯(lián)合結(jié)腸靶向益生菌干預IBS-D大鼠，通過動物實驗來探討其協(xié)同作用的機理，為臨床診治提供參考。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

成年健康清潔級Wistar大鼠(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(上海)2013-0016)。50只，體質(zhì)量(169.8±20)g，雌雄各半，SPF級實驗動物中心飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(23±3)℃，濕度(55±5)%，自然光照條件。將造模成功后的大鼠進行分組，共5組，分別為腸康方組、結(jié)腸靶向益生菌組、腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組、模型對照組及空白對照組。每組大鼠10只。

1.2 實驗藥物

1.2.1 腸康方

采用名老中醫(yī)驗方“腸康方”，已獲得國家發(fā)明專利(ZL201110336380.2)[2]。由白芍、防風、熟地黃、菟絲子、黃連、金蕎麥及蟬蛻7味中藥組成，組方藥材根據(jù) 2010 版《中國藥典》的相關(guān)規(guī)定項進行檢測，所有入藥的飲片均符合要求。分別加10倍、8倍量的水煎煮，每次1.5 h，合并煎煮液，濃縮至生藥量為0.5 g/mL，置4 ℃保存。用藥參照成人劑量，按照“動物體表面積比率換算等效劑量法”計算大鼠給藥量。

1.2.2 結(jié)腸靶向益生菌

結(jié)腸靶向益生菌膠囊為一種結(jié)腸定位釋放膠囊，擁有國家發(fā)明專利(CN00117989.6)[3]。膠囊內(nèi)益生菌為同一批次培菲康(雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌)，國藥準字S10950032；廠家：上海信誼；藥品電子監(jiān)管碼：81537950432214176108。并按照“動物體表面積比率換算等效劑量法”計算大鼠給藥量，每次灌服1個膠囊。

2 方法

2.1 IBS-D大鼠模型的建立

模型采用番瀉葉灌胃疊加束縛刺激法。Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)，實驗前10 h禁食不禁水，給予濃度為0.3 g/mL番瀉葉煎劑灌胃，灌胃體積為每千克體質(zhì)量10 mL，每天1次，灌服番瀉葉水1 h后立即用粗制的棉繩束縛大鼠的兩肢，使其活動不利，焦躁不安，形成一定的刺激，持續(xù)2 h，持續(xù)2周?？瞻讓φ战M正常飼養(yǎng)，不采取任何措施。

2.2 給藥和取材

腸康方組、結(jié)腸靶向益生菌組、腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組和模型對照組，分別給予腸康方灌胃、結(jié)腸靶向益生菌灌胃、腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌灌胃和等容積的蒸餾水灌胃；空白對照組給予等容積的蒸餾水灌胃。所有大鼠灌胃容積均為每千克體質(zhì)量10 mL，連續(xù)灌胃給藥2周。每日觀察一般情況，于末次給藥后次日空腹采血，測定各項指標，采血后處死并取全部結(jié)腸組織。

2.3 研究指標

2.3.1 一般情況

觀察大鼠的精神、活動、鼠毛、目光、食欲等情況，計算其腹瀉改善率。

2.3.2 大鼠腸道菌群的檢測

取新鮮無污染的大鼠糞便0.5 g，采用高通量測序的方法檢測腸道菌群物種的豐度、多樣性及構(gòu)成的變化趨勢，采用DNA抽提試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取，細菌多樣性鑒定對應區(qū)域：16S V3-V4區(qū)。

2.3.3 大鼠腸組織ZO-1的表達

將大鼠處死后，取近直腸端處約1 cm結(jié)腸，固定在甲醛中，用石蠟將其包埋，進行切片后再行免疫組化染色。免疫組化染色后，在顯微鏡下觀察，每個標本隨機選取5個視野，若出現(xiàn)棕黃色染色的顆粒為陽性反應，反之無棕黃染色則為陰性，每個視野利用拍攝器截取圖像保存。應用Image Pro Plus 軟件測定其陽性表達的光密度(optical density, OD)值進行半定量分析，取其平均值,以測定結(jié)腸ZO-1的表達。棕黃色染色越多，OD值就越大，水平越高。

2.4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包，以均數(shù)±標準差表示，采用q檢驗及LSD檢驗，P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的腹瀉情況

空白對照組大鼠大便正常，造模組大鼠造模前2 h排便粒數(shù)與空白對照組比較沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；造模開始后，造模組大鼠造模后大便變軟，或成稀狀、稀水狀，隨著時間推移情況無明顯好轉(zhuǎn)，2 h的排便粒數(shù)與空白對照組相比較明顯增多(P<0.01)。見表1。

表1 造模前后大鼠2 h排便粒數(shù)

藥物干預后，空白組大鼠在藥物干預期間大便正常，各藥物干預組大鼠腹瀉癥狀逐漸消失，大便逐漸恢復正常，而模型對照組與空白對照組相比，2 h排便粒數(shù)明顯增多；給藥干預組與模型對照組比較，2 h排便粒數(shù)均有不同程度的減少(P<0.05)，尤其以腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組的減少最為明顯(P<0.01)。見表2。

表2 藥物干預后各組大鼠2 h排便粒數(shù)

3.2 大鼠的腸道菌群變化

與空白對照組小鼠相比，IBS-D小鼠的α多樣性指標shannon指數(shù)明顯偏低，腸康方組、結(jié)腸靶向益生菌組及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組，shannon指數(shù)較模型組增加,見圖1。β多樣性分析結(jié)果見圖2，模型對照組與空白對照組大鼠腸道菌群OUT水平上的差異在PCoA及NMDS圖上能夠較好的區(qū)分，而給腸康方、結(jié)腸靶向益生菌及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌的IBS-D大鼠腸道菌群趨向于正常組。其中腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組IBS-D大鼠腸道菌群更趨向于正常組，說明腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組可更好維持腸道菌群的多樣性。

圖1 α多樣性分析

3.3 大鼠對照結(jié)腸組織ZO-1的表達

空白對照組大鼠腸組織中的ZO-1蛋白表達明顯。模型對照組與空白對照組相比，結(jié)腸黏膜組織中ZO-1蛋白表達顯著降低。腸康方組與模型對照組相比，大鼠腸組織ZO-1蛋白的表達增加不明顯，無統(tǒng)計學意義。結(jié)腸靶向益生菌組大鼠腸組織ZO-1蛋白表達稍有增加，但增加程度有限(P<0.05);腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組大鼠腸組織ZO-1蛋白表達增加較為顯著(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠腸組織ZO-1光密度值比較

圖2 β多樣性分析

4 討論

IBS-D是腸易激綜合征最常見的一個亞型，其病理機制尚不明確，目前認為其與腸道菌群失調(diào)、腸道黏膜屏障和免疫功能異常、腦腸軸失調(diào)等因素有關(guān)[4]。IBS-D的發(fā)生與腸道菌群失調(diào)關(guān)系密切[5]。腸道菌群具有保護腸道黏膜的完整性、防止病原體的入侵、調(diào)節(jié)胃腸道功能及免疫系統(tǒng)等作用[6-7]。腸道菌群之間與機體之間相互依賴生存、相互克制約束，保持動態(tài)平衡，一旦這種平衡被打破，則會引起免疫代謝紊亂，進而發(fā)生各種腸道疾病[3]。有研究表明，腸道菌群紊亂普遍存在于IBS-D患者中，表現(xiàn)為腸桿菌數(shù)量增多，乳桿菌、類桿菌及雙歧桿菌數(shù)量降低，菌群的密集度及多樣性顯著降低等[8]。郭文濤等[9]研究顯示，IBS-D患者的腸道菌群和健康人的腸道菌群相比多樣性下降(P<0.05)，提示IBS-D的發(fā)病與菌群失調(diào)有關(guān)。Gareau等[10]用母嬰分離法構(gòu)建的IBS-D大鼠模型，研究顯示模型組大鼠的腸道乳桿菌數(shù)減少。劉佳星等[11]通過高通量測序的方法研究發(fā)現(xiàn)“四神丸”可通過增加腸道內(nèi)益生菌豐度，減少有害菌豐度，來調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡，從而起到治療IBS-D的作用。

本次研究顯示腸康方、結(jié)腸靶向益生菌及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌均能改善IBS-D模型大鼠的腹瀉癥狀(P<0.05)，尤其是以腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組改善最為明顯(P<0.01)。通過對各組大鼠糞便進行高通量測序后發(fā)現(xiàn)給予腸康方、結(jié)腸靶向益生菌及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌的IBS-D大鼠腸道菌群均趨向于正常對照組，且腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組IBS-D大鼠的腸道菌群更趨向于正常對照組大鼠，說明腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌組可更好的維持IBS-D大鼠腸道菌群的多樣性。

腸黏膜屏障是人體最為重要的屏障之一，它是一道維持腸腔和機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的動能隔離帶，腸黏膜屏障可以使腸腔內(nèi)容物選擇性的通過，能夠有效的阻止病原體及其毒素侵入人體內(nèi)[12]。腸黏膜屏障功能與腸黏膜上皮細胞間的緊密連接(tight junction，TJ)息息相關(guān)[13]，TJ是一種能夠維持腸上皮黏膜屏障完整性的重要結(jié)構(gòu)[14]，而ZO蛋白對于TJ的構(gòu)成和屏障功能的維持具有重要的作用[15]。ZO-1可將跨膜蛋白和肌動蛋白系統(tǒng)連接在一起，構(gòu)成穩(wěn)定的細胞連接系統(tǒng)，常作為一種檢測緊密連接的標志性蛋白。有研究顯示[16],各亞型IBS大鼠存在腸黏膜機械屏障功能不足，表現(xiàn)為ZO-1減少。Martínez等[17]實驗顯示,IBS-D患者的腸黏膜中ZO-1 mRNA表達明顯低于正常人，ZO-1從TJ解離至細胞質(zhì)內(nèi)，因此可致TJ結(jié)構(gòu)功能失調(diào)，黏膜通透性改變，從而導致IBS-D的發(fā)生。

本實驗通過對各組大鼠腸組織免疫組化染色分析后發(fā)現(xiàn)IBS-D模型大鼠經(jīng)結(jié)腸靶向益生菌及腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌干預后腸組織ZO-1表達顯著增加，而以后者增加更為顯著，可見腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌能更好的通過增強黏膜屏障功能來達到治療IBS-D大鼠的作用。

腸康方為全國名老中醫(yī)驗方，由明朝《景岳全書》中“痛瀉藥方”及“心腎丸”化裁而來。方中君以白芍養(yǎng)血柔肝、緩急止痛，防風散肝舒脾、勝濕止瀉，既疏肝也能達到健脾的效用，全方共奏調(diào)和肝脾、緩痛止瀉等功效。前期動物實驗也顯示腸康方與陽性藥匹維溴銨均能通過減少腸組織5-羥色胺的表達，促進5-羥色胺轉(zhuǎn)運體的表達來達到改善IBS-D大鼠的癥狀(P<0.05)。李雪等[18]證實腸康方可使大鼠血漿P物質(zhì)減少，同時可使IBS-D大鼠結(jié)腸組織血管活性腸肽增多，以達到治療IBS-D的效果，且療效甚于陽性藥馬來酸曲美布汀。由此說明，腸康方對IBS-D有確切的療效。

綜上所述，腸康方聯(lián)用結(jié)腸靶向益生菌對IBS-D大鼠具有協(xié)同治療作用，可更好的改善模型大鼠的腹瀉癥狀，其機制可能與調(diào)節(jié)腸道菌群及增強腸黏膜屏障功能有關(guān)，但其多靶點的協(xié)同作用機制還有待進一步深入探索。