朱明瑾，羅斌，王戈，毛萌

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是指腦血管疾病引起腦損害導(dǎo)致的癡呆，是腦卒中的常見并發(fā)癥，是繼阿爾茨海默病之后第二常見的癡呆，其主要特征為認(rèn)知功能的受損及相關(guān)的神經(jīng)功能障礙。隨著腦卒中發(fā)病的逐年增加，VD的發(fā)病率近年也呈升高趨勢，其確切的發(fā)病機(jī)制，至今仍未明確。本實(shí)驗(yàn)采用自體血栓法建立血管性癡呆模型，觀察VD大鼠行為學(xué)變化及海馬區(qū)炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)的含量變化,旨在探討炎性反應(yīng)在VD發(fā)病中的作用。并采用益腎調(diào)氣中藥進(jìn)行干預(yù)治療,觀察益腎調(diào)氣中藥對(duì)VD大鼠行為學(xué)及海馬區(qū)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的影響,為VD的臨床治療尋找新的臨床思路及藥物。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Wistar雄性大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量(250±50)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2013-0006。飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由喂食和飲水(應(yīng)激時(shí)禁食、禁水除外)，室溫20 ℃～22 ℃(冷、熱應(yīng)激除外)，相對(duì)濕度60%～70%，光照周期12 h。

1.2 主要藥品與儀器

自擬醒神湯(由熟地黃、郁金、益智仁、當(dāng)歸、川芎等組成)，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥教研室鑒定；尼莫地平片(國藥準(zhǔn)字 H20003010)。Morris水迷宮程序自動(dòng)控制儀由北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備

大鼠常規(guī)喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)預(yù)篩選，計(jì)算所有大鼠的平均潛伏期，剔除過慢及過快的，根據(jù)潛伏期將剩余大鼠分為3個(gè)層次：0～20 s、20～40 s和40～60 s，從每層隨機(jī)選出10只老鼠，共計(jì)30只作為正常組，其余為造模組。

VD模型制備：首先制備自體血栓：大鼠頸總動(dòng)脈采血，之后將處理后的干燥血凝塊研細(xì)，并通過200 μm篩孔制成栓子，造模時(shí)用鹽水配成30 g/L的懸浮液。用10%水合氯醛(400 mg/kg)成功麻醉動(dòng)物，常規(guī)消毒后切開頸部正中，分離組織和筋膜，暴露左頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈。暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈近心端，并通過頸總動(dòng)脈的遠(yuǎn)心端將懸浮液推入頸內(nèi)動(dòng)脈以黏附血管傷口。立即打開頸總動(dòng)脈以恢復(fù)血流供應(yīng)，使栓子通過頸內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)入大腦前動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈及其側(cè)支，打開頸外動(dòng)脈，恢復(fù)血供和縫合。24 h后觀察造模是否成功。上述動(dòng)物養(yǎng)至4周后，通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)篩選出記憶障礙的癡呆大鼠。有顯著學(xué)習(xí)記憶障礙的大鼠為VD大鼠模型(以第一次水迷宮檢測的大鼠平均逃避潛伏期作為參考值，計(jì)算造模后大鼠平均逃避潛伏期和參考值之差與參考值的比值，超過20%為癡呆大鼠)。

2.2 動(dòng)物分組及給藥

將水迷宮篩選出的造模大鼠隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組，每組各10只。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，模型組灌胃雙蒸水，中藥組灌胃自擬醒神湯(濃度0.62 g/mL，4 ℃冰箱保存，臨用前加熱)，西藥組灌胃尼莫地平[9.45 mg/(kg·d)，灌胃前溶于雙蒸水中]。每周根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整灌胃量。每組大鼠每天按劑量胃內(nèi)給藥1次，共30 d。30 d后采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測學(xué)習(xí)記憶能力。

2.3 大鼠行為學(xué)測試

Morris水迷宮法檢測大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。

2.3.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

反映大鼠的學(xué)習(xí)能力。參照趙清山[1]方法測試，大鼠平臺(tái)逃避潛伏期為大鼠從入水到找到平臺(tái)后爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，以此作為大鼠空間學(xué)習(xí)能力的檢測指標(biāo)。

2.3.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

反映大鼠的記憶能力。參照趙清山[1]方法測試，第6天撤走平臺(tái)后依次將大鼠從各象限放入水中，分別記錄其跨越原來平臺(tái)的次數(shù)作為空間記憶的檢測指標(biāo)。大鼠完成定位航行實(shí)驗(yàn)后，于第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。

2.4 炎性細(xì)胞因子測定

ELISA法測定各組腦區(qū)TNF-α、IL-1β的含量變化。

檢測方法：將動(dòng)物斷頭后，將全腦剝離，并在冰盤上快速分離雙側(cè)海馬，稱重后(約需要200 mg)將其置于EP管中并用液氮快速冷凍，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。操作程序按說明書進(jìn)行。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以M±SE表示，單因素方差分析用于組間樣本均數(shù)比較(One-way ANOVA)，結(jié)合Post Hoc Multiple Comparison的LSD與SNK檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 行為學(xué)

3.1.1 各組大鼠平臺(tái)逃避潛伏期

正常組、西藥組和中藥組與模型組比較，正常組、西藥組和中藥組大鼠隱蔽平臺(tái)試驗(yàn)逃避潛伏期縮短(P<0.05)。見表1。

3.1.2 各組大鼠探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正常組、西藥組和中藥組與模型組比較，正常組、西藥組和中藥組大鼠停留原平臺(tái)象限時(shí)間延長(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠平臺(tái)逃避潛伏期的比較

表2 各組大鼠探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果及當(dāng)天的速度比較

3.2 炎性細(xì)胞因子

TNF-α：模型組較正常組明顯升高，有顯著差異(P<0.01)；正常組、中藥組、西藥組與模型組比較有顯著差異(P<0.01)；中藥組、西藥組兩組間無差異。IL-1β：模型組較正常組明顯升高，有顯著差異(P<0.01)；正常組、中藥組、西藥組與模型組比較有顯著差異(P<0.01)；中藥組、西藥組兩組間無差異。見表3。

表3 各組大鼠炎性細(xì)胞因子比較

4 討論

血管性癡呆屬于“呆病”“健忘”“癡呆”等范疇。筆者根據(jù)多年經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為腎虛肝郁在血管性癡呆的發(fā)病過程中起重要作用。課題組通過大量的臨床實(shí)踐研究，自擬醒神湯(熟地黃、郁金、益智仁、當(dāng)歸、川芎等)，該方由地黃飲子加減而成，方中熟地黃為君藥，具有益腎補(bǔ)精、滋陰養(yǎng)血等功效;郁金為臣藥，能行氣解郁、活血祛瘀、安神開竅;君臣合用有益腎調(diào)氣、祛瘀醒神之功效;諸藥合用，相輔相成。全方共奏補(bǔ)腎益氣、活血祛瘀、醒神開竅之效。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)研究亦證實(shí)：采用益腎調(diào)氣法治療血管性癡呆，可有效改善患者認(rèn)知、記憶、語言及視空間等方面的總積分，提高社會(huì)及日常生活能力?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)其藥物組成可直達(dá)病所，對(duì)疾病治療起到事半功倍的效果。研究發(fā)現(xiàn)[2]，熟地黃中的環(huán)烯醚萜類化合物——梓醇，能減少LDH的釋放，降低NO等炎癥因子的含量，而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用。郁金可以通過降低 MDA 的含量并提高腦組織中的 SOD 活性而對(duì)抗自由基的損傷[3]。

目前對(duì)于血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制仍未十分明了。有研究報(bào)道，炎性反應(yīng)在血管性癡呆的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[4-5]。炎性反應(yīng)是指活體組織對(duì)損傷因子的防御反應(yīng)，其基本的病理變化包括局部組織的變性、滲出和增生。炎癥反應(yīng)還參與腦白質(zhì)損傷的發(fā)生，并且在腦梗塞及隨后的繼發(fā)性神經(jīng)損傷中起重要作用。有研究表明，腦缺血時(shí)大量白細(xì)胞在多因素綜合作用下聚集在梗死區(qū)域及其周圍。炎性反應(yīng)在白細(xì)胞聚集的過程中發(fā)揮著重要的作用[6]。炎性細(xì)胞因子是腦缺血損傷過程產(chǎn)生的重要的免疫因子。根據(jù)在炎性反應(yīng)中的作用分為促炎因子和抗炎因子兩大類[7]。研究報(bào)道，炎性細(xì)胞因子在炎性反應(yīng)中相互作用是復(fù)雜的，并且具有一定的協(xié)同作用。如炎性因子TNF-α、IL-1β均可誘導(dǎo)IL-8的表達(dá)，形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并通過激活單核-吞噬細(xì)胞等，增強(qiáng)其殺傷及吞噬功能，從而加劇局部的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加重缺血性腦損傷[8]。

本實(shí)驗(yàn)采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和ELISA方法分別對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)及海馬中TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，自擬醒神湯組能縮短平臺(tái)試驗(yàn)逃避潛伏期，延長停留原平臺(tái)象限時(shí)間。提示該方能夠改善VD大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。ELISA方法測定炎性細(xì)胞因子中，與模型組比較，自擬醒神湯組能夠明顯降低海馬區(qū)TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平，提示自擬醒神湯能夠有效抑制炎性反應(yīng)，從而減輕血管性癡呆大鼠腦組織的損傷。然而其通過何種信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)炎性細(xì)胞因子起抑制作用，其深入的機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。