林曉紅,陳 柳,高亞娟,燕 鳳,李 佳,楊 紅

(中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,西安 710032;*通訊作者,E-mail:yanghongfck@163.com)

宮頸癌是發(fā)病率非常高的婦科惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著女性的生命健康,我國(guó)近10年來(lái)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)并且呈年輕化趨勢(shì)[1-3],如何有效地防控宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展顯得尤為重要。大量研究已經(jīng)證實(shí)宮頸癌發(fā)病的主要原因是人乳頭瘤病毒(HPV)的長(zhǎng)期持續(xù)感染[4,5]。HPV為小DNA病毒,呈球形,無(wú)包膜,20面立體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)?；蚪M是雙鏈環(huán)狀、以共價(jià)閉合的超螺旋、開(kāi)放的環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu)。侵染人的上皮黏膜細(xì)胞,通常引起生殖器疣、子宮頸和肛門(mén)癌。HPV的基因組包含3個(gè)基因區(qū):不編碼蛋白的長(zhǎng)調(diào)控區(qū)(LCR),早期基因區(qū)(E1,E2,E4,E5,E6,E7)和晚期基因區(qū)(L1,L2)。早期基因的產(chǎn)物用于病毒的復(fù)制擴(kuò)增,晚期基因的產(chǎn)物用于包裝病毒。其中,E6、E7為宮頸癌的致癌基因。宮頸癌作為目前唯一明確病因的婦科腫瘤,可以通過(guò)有效的篩查做到早發(fā)現(xiàn)早治療,從而有效防控宮頸癌前病變的發(fā)生與發(fā)展。目前宮頸癌篩查主要以細(xì)胞學(xué)和HPV基因檢測(cè)聯(lián)合篩查為主,對(duì)于疑似宮頸病變的患者轉(zhuǎn)陰道鏡活檢。臨床上對(duì)于子宮頸上皮內(nèi)瘤變的管理是按照規(guī)范操作,平衡利與弊,避免診斷與治療的不足與過(guò)度。因?yàn)镃IN1多為HPV一過(guò)性感染所致,自然消退率很高,因此對(duì)于低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變(LSIL,即CIN1)的患者,原則上是無(wú)需治療,隨診觀察。而對(duì)高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變(HSIL,即CIN2和CIN3)和原位癌患者,則應(yīng)及時(shí)予以治療,阻斷發(fā)展為子宮頸浸潤(rùn)癌的可能性,從而減少子宮頸浸潤(rùn)癌的發(fā)生。本研究通過(guò)比較分析HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)和HPV DNA分型檢測(cè)在臨床宮頸病變患者中的檢測(cè)結(jié)果,探討兩種HPV基因檢測(cè)方法在宮頸癌篩查中的應(yīng)用效果及對(duì)宮頸病變的診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料

回顧性分析2016年3月至2018年3月在本院婦科門(mén)診就診的患者(包括健康體檢者和有臨床癥狀表現(xiàn)為宮頸炎癥、陰道不規(guī)則出血等的患者,排除既往患有宮頸癌前病變、近期有激素使用史的患者),均行HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)和HPV DNA分型檢測(cè)的患者的臨床資料,其中發(fā)現(xiàn)疑似宮頸病變轉(zhuǎn)陰道鏡活檢的患者916例,年齡為20-76歲,平均年齡(42.7±11.9)歲。以活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),對(duì)HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)和HPV DNA分型檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 避開(kāi)月經(jīng)期,取樣前3 d內(nèi)無(wú)陰道上藥和沖洗,24 h內(nèi)無(wú)性生活,采用專(zhuān)用的采樣刷,于宮頸鱗狀上皮和柱狀上皮交界處,沿順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)5-7圈后置于專(zhuān)用的標(biāo)本保存液中。

1.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 使用Quanti VirusTMHPV E6/E7 mRNA檢測(cè)試劑盒(試劑盒和檢測(cè)儀器來(lái)源于河南科蒂亞生物技術(shù)有限公司)可檢測(cè)WHO公布的14種高危亞型HPV E6/E7 mRNA(HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68),不分型。采用支鏈DNA信號(hào)放大技術(shù),標(biāo)本經(jīng)過(guò)裂解、雜交捕獲、信號(hào)放大、酶促化學(xué)發(fā)光,通過(guò)冷光儀檢測(cè),超過(guò)發(fā)光閾值為陽(yáng)性。

1.2.3 HPV DNA分型檢測(cè) 使用HPV27全分型檢測(cè)試劑盒(源于上海透景生命科技股份有限公司)可檢測(cè)13種高危亞型HPV(HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66)和4種可能高危亞型HPV(HPV 68,26,53,82)及10種低危亞型(HPV 6,11,40,42,43,44,55,61,81,83)。采用流式熒光技術(shù),標(biāo)本經(jīng)過(guò)核酸提取,PCR擴(kuò)增、雜交,通過(guò)Luminex-200儀檢測(cè)信號(hào),結(jié)果大于150的型別為陽(yáng)性。

1.2.4 陰道鏡檢查及宮頸活檢 宮頸充分暴露后,使用4%醋酸溶液涂抹整個(gè)宮頸,全面觀察后用碘液涂抹,充分觀察對(duì)白色病變、點(diǎn)狀血管、碘不著色等可疑病變部位行多點(diǎn)取樣及宮頸搔刮術(shù)。采集的活檢組織使用甲醛固定處理,送至病理科進(jìn)行活檢:標(biāo)本經(jīng)脫水、組織包埋、切片、染色、封片后,由2位專(zhuān)業(yè)的病理診斷醫(yī)生進(jìn)行閱片診斷,診斷結(jié)果描述采用世界衛(wèi)生組織三級(jí)分類(lèi)法,分為宮頸炎癥、輕度宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN1)、中度宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN2)、重度宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN3)和宮頸癌。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比、陰性似然比及ROC曲線下面積指標(biāo)評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)方法診斷價(jià)值,不同宮頸病變分組中HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)采用中位數(shù)(四分位數(shù))表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 916例行陰道鏡活檢患者檢測(cè)結(jié)果概況

916例患者的活檢結(jié)果:宮頸炎239例,CIN1 342例,CIN2 91例,CIN3 183例,宮頸癌61例。CIN1-3患者共616例,年齡分布:20-29歲79例(12.8%),30-39歲230例(37.4%),40-49歲211例(34.3%),50-59歲71例(11.5%),60-69歲23例(3.7%),年齡≥70歲2例(0.3%)。61例宮頸癌患者年齡分布為:20-29歲2例(3.3%),30-39歲13例(21.3%),40-49歲23例(37.7%),50-59歲14例(23.0%),60-69歲9例(14.7%)。在高級(jí)別宮頸病變(CIN2以上)及宮頸癌的335例患者中,單一高危亞型感染率高的型別有HPV16、58、33、31、56、18、52,占比75.6%;雙重感染的患者共39例,占比11.6%。在61例宮頸癌患者中感染HPV16高危亞型的33例,占比54.0%,感染HPV18亞型的6例,占比9.8%。

2.2 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型檢測(cè)結(jié)果分析

在炎癥組中,HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率低于HPV DNA分型檢測(cè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在CIN1和CIN2組中,兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CIN3組和宮頸癌組的HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率高于HPV DNA分型檢測(cè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表1)。

表1 916例活檢患者HPVE6/E7mRNA和HPV DNA分型檢測(cè)結(jié)果分析 例(%)

2.3 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型檢測(cè)對(duì)宮頸病變篩查的臨床價(jià)值比較

為了進(jìn)一步明確HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型檢測(cè)在宮頸病變篩查中的臨床價(jià)值,本研究在活檢結(jié)果的基礎(chǔ)上比較了兩種HPV基因檢測(cè)方法的靈敏度、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比和陰性似然比(見(jiàn)表2)。結(jié)果表明,HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值,陽(yáng)性似然比均高于HPV DNA分型檢測(cè),陰性似然比則低于HPV DNA分型檢測(cè)。上述差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA分型檢測(cè)對(duì)宮頸病變?cè)\斷的臨床價(jià)值比較

2.4 不同級(jí)別宮頸病變分組中HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果分析

本研究根據(jù)不同宮頸病變級(jí)別分組,統(tǒng)計(jì)了不同分組中陽(yáng)性患者HPV E6/E7 mRNA的拷貝數(shù)。結(jié)果表明HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)隨著宮頸病變級(jí)別的加重而增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)表3)。

表3 不同宮頸病變級(jí)別的HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)

3 討論

HPV感染大多都是一過(guò)性感染,80%以上的婦女一生中都會(huì)感染HPV,但是大部分感染都可以在8-24個(gè)月內(nèi)通過(guò)自身免疫系統(tǒng)清除,只有約9%-21%會(huì)發(fā)展為持續(xù)感染[6]。在感染早期,病毒基因在細(xì)胞內(nèi)處于游離狀態(tài),一過(guò)性感染大多處于這個(gè)階段。當(dāng)HPV持續(xù)感染后,病毒基因整合到宿主細(xì)胞基因組中,HPV致癌基因E6、E7被激活,利用宿主細(xì)胞大量轉(zhuǎn)錄mRNA并翻譯為E6、E7致癌蛋白。E6蛋白能夠通過(guò)與E3泛素化連接酶E6AP結(jié)合形成復(fù)合體,進(jìn)一步泛素化修飾p53,使得p53最終被蛋白酶降解而失去功能。由此導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂癌變,而隨著細(xì)胞的不斷增殖,病毒也得以大量擴(kuò)增。還有研究表明E6蛋白可以激活細(xì)胞端粒酶。由于端粒酶本身具有抑制細(xì)胞程序性死亡的作用,因此激活端粒酶可以延長(zhǎng)宿主細(xì)胞生存時(shí)間。E6蛋白不僅自身具有致癌作用,還可與其他致癌蛋白合作,高效地誘導(dǎo)細(xì)胞癌變。與E6生物學(xué)功能相關(guān)最密切的就是E7。有文獻(xiàn)報(bào)道,E7可以使抑癌因子pRB失活,導(dǎo)致細(xì)胞癌變。此外,作為抗病毒機(jī)制,細(xì)胞間會(huì)通過(guò)干擾素進(jìn)行通訊,而E6、E7蛋白不僅可以下調(diào)多種干擾素應(yīng)答基因還可以直接降低兩種干擾素的表達(dá)量,使得病毒逃逸人體免疫[7],另外,E6、E7蛋白可以激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT),增強(qiáng)惡性細(xì)胞的侵襲力[8-10]。因此,近年來(lái),大量國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為E6/E7 mRNA的持續(xù)大量表達(dá)是宮頸癌變的必要條件。有研究表明在宮頸癌篩查中HPV E6/E7 mRNA較HPV DNA有相近的靈敏度和更高的特異度[11]。

HPV DNA檢測(cè)是以HPV的L1基因?yàn)榘袠?biāo),無(wú)法排除一過(guò)性感染,易引起過(guò)度診療,增加患者生理上的痛苦和心理上的負(fù)擔(dān)。而HPVE6/E7 mRNA檢測(cè)是以HPV的致癌基因E6、E7轉(zhuǎn)錄的mRNA為靶標(biāo),可以反映致癌基因的活躍程度,理論上能更好反映癌變轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn),同時(shí)可以有效減少HPV一過(guò)性感染的檢出,減少不必要的陰道鏡轉(zhuǎn)診。有研究報(bào)道活檢結(jié)果為CIN1患者有47%-62%可以轉(zhuǎn)為正常,22%-37%維持原狀,15%-16%會(huì)進(jìn)一步進(jìn)展;CIN2患者有43%-54%可以轉(zhuǎn)為正常,16%-35%維持原狀,30%會(huì)進(jìn)一步進(jìn)展;CIN3患者只有20%-30%可以轉(zhuǎn)為正常,70%-80%會(huì)進(jìn)一步進(jìn)展。因此如何準(zhǔn)確地篩查分流出宮頸病變高風(fēng)險(xiǎn)的患者,及時(shí)治療阻斷宮頸癌發(fā)生發(fā)展顯得尤為重要。

本研究結(jié)果顯示,在活檢結(jié)果為宮頸炎癥的患者中HPV E6/E7 mRNA的陽(yáng)性率遠(yuǎn)低于HPV DNA檢測(cè)的陽(yáng)性率,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Baron等[12]的結(jié)果一致。這可能是由于大多數(shù)HPV感染是一過(guò)性感染,病毒基因并未整合到宿主基因中或者整合程度低,HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)呈陰性,表示樣本宮頸細(xì)胞無(wú)惡變轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)或者處于靜止期,但HPV DNA檢測(cè)仍可以檢測(cè)到HPV病毒的存在。在CIN3以上的宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)病變中,HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)的陽(yáng)性率高于HPV DNA檢測(cè),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中有7例宮頸癌患者的HPV E6/E7 mRNA呈陽(yáng)性而HPV DNA檢測(cè)呈陰性,可能是在病毒基因整合到宿主基因時(shí),發(fā)生了L1丟失,因此HPV DNA檢測(cè)呈陰性;另一方面,血性標(biāo)本也會(huì)影響HPV DNA分型檢測(cè)的結(jié)果。本研究結(jié)果還顯示,在高級(jí)別上皮內(nèi)病變(CIN2及以上)患者中HPV E6/E7 mRNA的靈敏度、特異性,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性似然比以及ROC曲線下面積AUC均比HPV DNA分型檢測(cè)高,表明HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)宮頸病變?cè)\斷的臨床價(jià)值更高。

宮頸病變的發(fā)生和發(fā)展與感染HPV的型別、病毒載量和致癌基因的活躍程度密切相關(guān)[13]。在14種高危亞型HPV中,HPV16和HPV18與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系最密切。本研究結(jié)果顯示,61例活檢結(jié)果為宮頸癌的患者,感染HPV16高危亞型的33例,占比54.0%,感染HPV18亞型的6例,占比9.8%,雙重感染5例,占比8.2%,雙重感染者均感染HPV16或HPV18,由HPV16和HPV18引起的宮頸癌占72%,這與Lees等[14]的研究結(jié)果一致。因此對(duì)于HPV16和18陽(yáng)性的患者應(yīng)引起足夠重視,另外HPV58、33、31、52、56陽(yáng)性也應(yīng)引起重視。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果拷貝數(shù)在不同程度宮頸病變分組之間存在顯著差異,HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)隨著宮頸病變程度增加而升高,這與國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道一致,HPV E6/E7 mRNA的拷貝數(shù)與宮頸病變的嚴(yán)重程度相關(guān)[15-17]。HPV E6/E7mRNA拷貝數(shù)反映著HPV致癌基因表達(dá)的活躍程度,拷貝數(shù)越高表示樣本宮頸細(xì)胞惡變轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)越高。對(duì)于細(xì)胞學(xué)篩查結(jié)果為ASCUS以及病理結(jié)果為CIN1-2的患者,可以根據(jù)E6/E7 mRNA拷貝數(shù)進(jìn)行分流。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)于篩查出宮頸病變高風(fēng)險(xiǎn)的患者,并及時(shí)采取治療,阻斷宮頸癌發(fā)生發(fā)展具有重要的參考意義。

宮頸癌篩查最理想的結(jié)果是篩查益處最大化,潛在風(fēng)險(xiǎn)最小化:需要識(shí)別可能發(fā)展為浸潤(rùn)癌的宮頸癌前病變和原位癌并及時(shí)給予阻斷治療,還要避免對(duì)一過(guò)性HPV感染及其導(dǎo)致的良性病變的探查和不必要的治療,甚至過(guò)度治療。本研究表明,HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與高級(jí)別宮頸病變的相關(guān)性更強(qiáng),對(duì)宮頸病變的發(fā)生發(fā)展有很好的預(yù)測(cè)意義,對(duì)宮頸病變的診斷價(jià)值高于HPV DNA分型檢測(cè),是臨床診療中更高效可靠的篩查方法。