高 潔,趙瑋欽,程 政

(1陜西省顱頜面精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安 710004;2西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院綜合科;3西安科技大學(xué)化工學(xué)院;4國(guó)土資源部煤炭資源勘查與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;*通訊作者,E-mail:gaojie-12@163.com)

齲病是危害人類口腔健康最普遍的疾病,其發(fā)病率高,分布廣,是世界上最流行的疾病之一[1]。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)是人類口腔主要的致齲菌,它可以利用蔗糖形成細(xì)胞外多糖,黏附并定植于牙齒表面,促進(jìn)牙菌斑生物膜的形成[2]。以生物膜形式存在的變異鏈球菌才有可能在復(fù)雜多變的口腔環(huán)境中賴以生存。牙菌斑生物膜形成后進(jìn)一步促進(jìn)致齲菌對(duì)牙釉質(zhì)黏附,增強(qiáng)致齲菌的產(chǎn)酸能力,并能抵抗藥物的滲透能力,加速了齲病的發(fā)生。密度感應(yīng)(quorum sensing, QS)是變異鏈球菌調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要部分[3],調(diào)節(jié)變異鏈球菌的基因感受刺激多肽、生物膜的形成及耐酸反應(yīng),影響生物膜中細(xì)菌的適應(yīng)和毒力因子的產(chǎn)生[4],其中ComCDE系統(tǒng)[3]與生物膜中g(shù)tfB、gtfC、gbpB等相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān);LuxS系統(tǒng)可以催化信號(hào)肽AI-2形成,抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)以及耐酸能力[5]。因此,干擾變異鏈球菌毒力基因的表達(dá)對(duì)密度感應(yīng)系統(tǒng)及生物膜的形成具有重要作用。

齲病的有效防治一直是國(guó)內(nèi)外關(guān)注的熱點(diǎn),公認(rèn)的氟化物防齲、抗菌藥物的應(yīng)用以及免疫防齲等方法均有一定的局限性。近年來(lái),天然藥物因產(chǎn)地豐富、抗菌活性強(qiáng)、毒性低等優(yōu)勢(shì)在齲病防治中受到了關(guān)注[6]。研究表明,原花青素對(duì)變異鏈球菌生物膜的蛋白具有抑制作用[7]。本研究探討石榴皮原花青素對(duì)變異鏈球菌生物膜的形成及相關(guān)毒力基因表達(dá)的影響,以期達(dá)到防治齲病的目的。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

變異鏈球菌UA159:空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院提供;腦心浸液培養(yǎng)基(BHI):青島海博生物科技有限公司;氯已定(Chlorhexidine, CHX)、甲基四氮鹽(XTT):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;引物:上海博尚生物技術(shù)有限公司;Total RNA提取試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR預(yù)混液、反轉(zhuǎn)錄試劑盒:賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀:賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;多功能酶標(biāo)儀:山東博科科學(xué)儀器有限公司;微孔板培養(yǎng)箱(SI19):上海昕瑞儀器儀表有限公司;紫外分光光度計(jì)UV-5800H(PC):上海元析儀器有限公司;生物安全柜(BHC-1000IIA2)、厭氧培養(yǎng)箱(YQX-II)：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用：安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

1.2 變異鏈球菌液制備

變異鏈球菌UA159在厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃靜置厭氧培養(yǎng)(10% CO2、10% H2、80% N2),革蘭氏染色鏡檢菌落生長(zhǎng)形態(tài),確認(rèn)無(wú)污染后,將單個(gè)菌落接種到BHI培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,利用紫外分光光度計(jì)將菌液濃度調(diào)至OD600=0.1備用。

1.3 石榴皮原花青素溶液配制

石榴皮原花青素為西安科技大學(xué)化工學(xué)院提供,用無(wú)菌水配制成320 mg/ml的母液置于4 ℃保存;工作液用BHI液體培養(yǎng)基將石榴皮原花青素母液稀釋成160 mg/ml;氯已定(chlorhexidine,CHX)用BHI液體培養(yǎng)基稀釋成40 mg/ml。

1.4 生物膜形成最低抑制濃度測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)分為4組:石榴皮原花青素組、氯已定組、空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組采用BHI液體培養(yǎng)基;陰性對(duì)照組采用含變異鏈球菌UA159菌液的BHI液體培養(yǎng)基。

實(shí)驗(yàn)濃度每組4個(gè)重復(fù)。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中1-7號(hào)孔均加入100 ml的BHI培養(yǎng)液,2-6號(hào)A-D孔加入100 μl濃度為160 mg/ml的石榴皮原青花素工作液,依次進(jìn)行倍比稀釋后,每孔石榴皮原花青素濃度分別為40,20,10,5,2.5 mg/ml;2-6號(hào)E-H孔加入100 μl濃度為40 mg/ml的CHX工作液,依次進(jìn)行倍比稀釋后,氯已定濃度分別為10,5,2.5,1.25,0.625 mg/ml。1號(hào)孔空白對(duì)照組再次加入100 ml的BHI培養(yǎng)液,2-7號(hào)各孔依次加入變異鏈球菌UA159菌液100 μl 1×106CFU/ml,7號(hào)孔為陰性對(duì)照組。96孔板置于CO2厭氧培養(yǎng)箱37 ℃孵育48 h,去除培養(yǎng)液后用無(wú)菌PBS緩沖液洗板3次,每孔加入XTT溶液100 μl,避光培養(yǎng)2 h后酶標(biāo)儀A490 nm讀數(shù)。MIC為抑制變異鏈球菌生物膜形成最低藥物濃度,分別計(jì)算石榴皮原花青素組與氯已定組影響變異鏈球菌生物膜的抑制率:

1.5 瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性

100 ml BMI瓊脂糖培養(yǎng)基滅菌后冷至50 ℃,加入5 ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的變異鏈球菌UA159懸液(菌體數(shù)107個(gè)/ml),混勻后倒入培養(yǎng)皿(直徑9 cm),每皿20 ml,放置40 min,使培養(yǎng)基固化。用無(wú)菌打孔器在培養(yǎng)基上均勻打孔(直徑6 mm),向孔中加入100 μl樣品,DMF作空白對(duì)照。石榴皮原花青素濃度為10 mg/ml;氯已定濃度為2.5 mg/ml。37 ℃培養(yǎng)18 h,測(cè)量抑菌圈直徑(單位:mm)。

1.6 變異鏈球菌總RNA的提取

濃度為5 mg/ml和10 mg/ml石榴皮原花青素組、2.5 mg/ml氯已定組、空白組,分別在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中將變異鏈球菌UA159培養(yǎng)48 h后,去除培養(yǎng)液,用無(wú)菌PBS緩沖液沖洗3次,用細(xì)胞鏟將生物膜態(tài)變異鏈球菌收集到2 ml離心管中,各離心管中分別加入35 mg/ml的溶解酶500 μl,混勻后于37 ℃孵育4 h之后操作均在室溫中進(jìn)行。依照試劑盒說(shuō)明書RNAisoTM Plus(Total RNA提取試劑)提取細(xì)菌總RNA。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄變異鏈球菌毒力基因RNA

依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的步驟將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA,置于-20 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 real-time PCR檢測(cè)變異鏈球菌UA159毒力基因luxS,gtfB,gbpD,brpA和ftf的表達(dá)

利用NCBI Primer-BLAST設(shè)計(jì)最優(yōu)引物(見(jiàn)表1)。PCR反應(yīng)體系為25 μl:2×Taq PCR Mastermix 12.5 μl,上下游引物各0.5 μl,DNA模板1 μl,ddH2O補(bǔ)足25 μl反應(yīng)體積。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,61 ℃退火30 s,30個(gè)循環(huán)。real-time PCR擴(kuò)增完成后分析熔解曲線。如果Ct值≤35則判定為陽(yáng)性,Ct值>35或無(wú)Ct值判定為陰性。每個(gè)樣品均設(shè)毒力基因檢測(cè)管與內(nèi)參基因檢測(cè)管,采用2-ΔΔCt對(duì)樣本進(jìn)行相對(duì)定量。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組數(shù)據(jù)間比較采用Studentt檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)間比較采用One-way ANOVA檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 石榴皮原花青素和CHX對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的影響

隨著石榴皮原花青素和CHX藥物濃度的增加,吸光度值A(chǔ)值減小(見(jiàn)圖1)。10 mg/ml石榴皮原花青素和2.5 mg/ml CHX的吸光度A值都顯著減小,其抑制率顯著增強(qiáng)(見(jiàn)圖1)。石榴皮原花青素對(duì)變異鏈球菌的MIC為10 mg/ml,抑制率為91.9%;CHX對(duì)變異鏈球菌的MIC為2.5 mg/ml,抑制率為90.9%(見(jiàn)表2)。

圖1 石榴皮原花青素和氯己定對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的吸光值Figure 1 Effect of pomegranate peel procyanidins and CHX on absorbance of Streptococcus mutans biofilm

表2 石榴皮原花青素和CHX對(duì)變異鏈球菌生物膜形成的抑制率

2.2 瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定抑菌活性

瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法結(jié)果顯示,加入100 μl 10 mg/ml石榴皮原花青素,37 ℃培養(yǎng)18 h后,形成的抑菌環(huán)外徑為28 mm;加入100 μl 2.5 mg/ml CHX,37 ℃培養(yǎng)18 h后,形成的抑菌環(huán)外徑為24 mm(見(jiàn)圖2)。石榴皮原花青素和CHX均可以形成明顯的抑菌環(huán),可見(jiàn)石榴皮原花青素和CHX均可以有效抑制變異鏈球菌UA159的生長(zhǎng)。

2.3 石榴皮原花青素對(duì)變異鏈球菌毒力基因luxS,gtfB,gbpD,brpA和ftf表達(dá)水平的影響

根據(jù)石榴皮原花青素和CHX對(duì)變異鏈球菌UA159的MIC結(jié)果,選取5 mg/ml石榴皮原花青素、10 mg/ml石榴皮原花青素及2.5 mg/ml CHX分別作用變異鏈球菌UA159,檢測(cè)變異鏈球菌UA159毒力基因luxS,gtfB,gbpD,brpA和ftf的mRNA表達(dá)水平,10 mg/ml石榴皮原花青素和2.5 mg/ml CHX分別作用于變異鏈球菌UA159后,各毒力基因mRNA的表達(dá)水平與空白對(duì)照組相比均顯著下調(diào)(P<0.01)。10 mg/ml石榴皮原花青素和2.5 mg/ml CHX對(duì)變異鏈球菌UA159毒力基因的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖3)。

A.空白對(duì)照B.10 mg/ml石榴皮原花青素 C.2.5 mg/ml CHX圖2 瓊脂糖孔穴擴(kuò)散法測(cè)定石榴皮原花青素和CHX對(duì)變異鏈球菌的抑菌活性Figure 2 Both pomegranate peel procyanidins and chlorhexidine effectively inhibit Streptococcus mutans by agarose hole diffusion method

3 討論

原花青素(proantho cyanidins,PC)是以黃烷-3-醇為結(jié)構(gòu)單元通過(guò)C-C鍵聚合而形成的化合物,又名縮合鞣質(zhì),是自然界中廣泛存在的一類聚多酚類混合物。人們對(duì)眾多不同植物中提取出的PC進(jìn)行了大量研究,發(fā)現(xiàn)PC具有抗氧化清除自由基活性;抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng);誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[8,9]。原花青素由于來(lái)源廣泛、毒副作用小,近年來(lái)也用于了口腔方面的研究。最常見(jiàn)是從葡萄籽中提取的原花青素,它具有抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸、減少大鼠齲病發(fā)生的作用[10],可以通過(guò)促進(jìn)一氧化氮合酶合成一氧化氮抑制變異鏈球菌生長(zhǎng)[11]。同時(shí)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)高粱原花青素(SPC)四聚體對(duì)引起齲病的主要致病菌變異鏈球菌的黏附有抑制作用[12,13]。

石榴皮為石榴科石榴干燥的果皮,其中含有大量原花青素。石榴皮中含有的多酚類物質(zhì),主要包括鞣質(zhì)化合物和黃酮化合物,新鮮石榴皮中黃酮含量為6%左右,原花青素為其主要的黃酮化合物成分。石榴皮原花青素對(duì)多種細(xì)菌和真菌都具有抑制作用,柯春林等[14]報(bào)道石榴皮原花青素提取液對(duì)單增李斯特菌有明顯的抑菌活性。如今,石榴皮原花青素的抑菌機(jī)制尚無(wú)明確定論,推測(cè)可能是抑制菌體細(xì)胞蛋白的合成及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體分裂,使菌體表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)均發(fā)生改變,從而導(dǎo)致細(xì)胞壁被破壞,引起細(xì)胞核固縮,最終使菌體的生長(zhǎng)繁殖受到抑制而死亡[15]。

變異鏈球菌是牙菌斑的主要致病菌,抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)和生物膜形成對(duì)防齲具有的重要的作用。氯己定雖然可以有效抑制變異鏈球菌,但是用于防齲的同時(shí)常對(duì)口腔正常菌群造成破壞,長(zhǎng)期使用還會(huì)引起口腔著色和味覺(jué)改變,這些副作用限制了氯己定在口腔局部的長(zhǎng)期應(yīng)用。我國(guó)石榴產(chǎn)量高,石榴皮作為一種天然抑菌植物資源,對(duì)于解決致病菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)的問(wèn)題具有一定優(yōu)勢(shì)。因此,本實(shí)驗(yàn)中采用氯己定作為陽(yáng)性對(duì)照,探討石榴皮原花青素對(duì)變異鏈球菌生物膜的抑制。研究發(fā)現(xiàn)石榴皮花原青素可以有效抑制變異鏈球菌生物膜,推測(cè)其可能是通過(guò)抑制變異鏈球菌相關(guān)毒力基因的表達(dá)而影響其生物膜形成。因此,石榴皮原花青素作為一種新型開發(fā)的天然防齲藥物具有良好的應(yīng)用前景。