陳 曦,龔建平,楊小李

1.重慶市武隆區(qū)人民醫(yī)院外一科，重慶 408500；2.重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院肝膽外科，重慶 400010；3.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州 646000；4.西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院四川省院士工作站，四川瀘州 646000

肝硬化是肝細胞癌(簡稱肝癌)發(fā)生的高危因素。在我國，80%以上的肝癌患者合并肝硬化[1]。因此，尋找分子標志物預測肝硬化向肝癌的惡性轉化，采用不同的隨訪策略，是改善肝硬化預后的重要方法。研究表明代謝異常是癌癥發(fā)生的關鍵驅動因子[2]，許多糖酵解的節(jié)點分子，如M2型丙酮酸激酶(PKM2)、低氧誘導因子-1(HIF1α)及LncRNA IDH1-AS1等，均被證實在癌癥的發(fā)生中發(fā)揮重要作用[3-4]。AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)是細胞能量狀態(tài)的“傳感器”。已有研究顯示AMPK低活化與肝癌預后不良有關[5]，AMPK的經典激活劑二甲雙胍可抑制肝癌發(fā)生[6]，因此，AMPK的活化異?？赡芫哂蓄A測肝硬化-肝癌惡性轉化的作用。在本研究中，筆者檢測肝硬化組織標本中活化的AMPK(p-AMPK)的表達，分析其與肝癌發(fā)生的關系。現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集1999年1月至2011年6月因肝硬化門靜脈高壓癥在重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院行Hassab聯(lián)合肝活檢術的患者。排除無法獲取詳盡的臨床資料215例，組織標本不足以制作組織芯片147例，未規(guī)律隨訪158例。最終制作完成的組織芯片來自426例肝硬化患者(以下簡稱重醫(yī)隊列)。本研究方案經由重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會審批(批號：2016-102)，所納入患者均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 試劑：SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋：SP9001)，p-AMPK(Thr172)抗體 (CST：8208)。

1.3方法 隨訪時間間隔為3～6個月，隨訪常規(guī)項目包括血常規(guī)、肝腎功能、甲胎蛋白(AFP)和腹部彩超，如果有可疑肝癌病灶，則進一步行增強CT、MRI或肝穿刺活檢。筆者將Hassab術后仍有每周大于1次的飲酒定義為有飲酒史，將手術后發(fā)生過上消化道出血定義為有上消化道出血史。2型糖尿病的診斷參照國際通用WHO(1999年)標準。隨訪終點為發(fā)現肝癌或至2016年12月，中位隨訪時間87.0個月。

采用四川大學華西醫(yī)院石毓君教授贈予的組織芯片進一步驗證本研究結果，該組織芯片包含1995-2009年在華西醫(yī)院取得的152份乙型肝炎后肝硬化標本，最終納入131份采用Hassab手術患者的標本作為驗證隊列(以下簡稱華西隊列)。華西醫(yī)院與重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院的隨訪時間間隔及隨訪項目相同，隨訪終點為發(fā)現肝癌或至2014年5月，中位隨訪時間84.5個月。標本收集時已通過華西醫(yī)院倫理委員會審查。

1.4免疫組化結果判讀 (1)染色深度：0分為無染色，1分為淡黃色，2分為黃或深黃色，3分為褐或棕褐色；(2)陽性細胞數：0分為陽性細胞數≤5%，1分為陽性細胞數>5%～25%，2分為陽性細胞數>25%～50%，3分為陽性細胞數>50%～75%，4分為陽性細胞數>75%；染色深度與陽性細胞數得分相加為總得分，總得分0～1為陰性，2～3為弱陽性，4～8為中等陽性，9～12為強陽性，將陰性與弱陽性歸為p-AMPK低表達組;中等陽性與強陽性歸為p-AMPK高表達組。兩位經驗豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法觀察，若有爭議，最終協(xié)商一致的結果為最終結果。陽性對照為已知p-AMPK高表達的肝組織切片，陰性對照為不加一抗的磷酸緩沖鹽溶液。

2 結 果

2.1肝硬化組織中p-AMPK的表達與基本臨床資料的關系 p-AMPK陽性染色定位于細胞質，見圖1。332例(77.9%)為p-AMPK高表達，94例(22.1%)為p-AMPK低表達。p-AMPK低表達組有上消化道出血史、Child-Pugh B或C級及糖尿病的患者所占比例均高于p-AMPK高表達組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同p-AMPK表達水平的患者年齡、性別、病因、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、γ谷氨酰轉移酶(GGT)、清蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、AFP、腹腔積液、飲酒史和肝性腦病差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同p-AMPK表達水平患者臨床資料的比較(重醫(yī)隊列)

續(xù)表1 不同p-AMPK表達水平患者臨床資料的比較(重醫(yī)隊列)

圖1 p-AMPK在肝硬化組織中表達的典型免疫組化圖

2.2p-AMPK的表達與肝硬化-肝癌惡性轉化的相關性分析 隨訪結束后，非肝癌致死61例(14.3%)，發(fā)生肝硬化-肝癌惡性轉化41例(9.6%)。Hassab術后1、3、5、10年，p-AMPK低表達與p-AMPK高表達患者肝癌發(fā)生率分別為3.1%、9.6%、13.8%、30.6%和0.0%、0.3%、0.3%、8.0%。Fine and Gray模型分析顯示，p-AMPK低表達組具有更高的肝癌發(fā)生率，見圖2。單因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達是肝硬化-肝癌惡性轉化的危險因素(HR=6.25，95%CI:3.36～11.60，P<0.001)。多因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達是肝硬化-肝癌惡性轉化的獨立危險因素(HR=6.00,95%CI:3.24～11.10,P<0.001)。以Child-Pugh分級、糖尿病和飲酒史進行分層研究，同樣顯示p-AMPK的表達水平與肝硬化-肝癌惡性轉化率呈負相關，見圖3。

圖2 重醫(yī)隊列p-AMPK的表達對肝癌發(fā)生的影響

注：A、D為以糖尿病分層時肝癌發(fā)生情況；B、E為以飲酒史分層時肝癌發(fā)生情況；C、F為以Child-Pugh分級分層時肝癌發(fā)生情況。圖3 重醫(yī)隊列p-AMPK對肝癌發(fā)生的影響亞組分析

2.3華西隊列檢驗p-AMPK與肝硬化-肝癌惡性轉化發(fā)生的相關性 華西隊列中ALT水平低于重醫(yī)隊列，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；華西隊列中肝硬化的病因均為HBV感染，男性和Child-Pugh B或C級患者的比例低于重醫(yī)隊列，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其余已知變量在兩個隊列之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。華西隊列中，p-AMPK低表達患者與重醫(yī)隊列相比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。p-AMPK低表達組ALT和AST水平高于p-AMPK高表達組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余已知變量在兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。Fine and Gray模型分析結果與重醫(yī)隊列相似，p-AMPK低表達組具有更高的肝癌發(fā)生率，見圖4。單因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達是肝硬化-肝癌惡性轉化的危險因素(HR=8.49，95%CI：2.93～24.6，P<0.001)。多因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達是肝硬化-肝癌惡性轉化的獨立危險因素(HR=13.40,95%CI:5.14～34.90,P<0.001)。

圖4 華西隊列p-AMPK的表達對肝癌發(fā)生的影響

表2 華西隊列與重醫(yī)隊列患者基本信息比較

續(xù)表2 華西隊列與重醫(yī)隊列患者基本信息比較

表3 不同p-AMPK表達水平患者臨床資料的比較(華西隊列)

3 討 論

AMPK是細胞“能量調節(jié)器”，低能量會激活AMPK，增強產能代謝并抑制耗能代謝，從而維持細胞能量穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現AMPK與腫瘤的發(fā)生關系密切[5-6]。敲除AMPK α亞基抑制AMPK活化可促進有氧糖酵解(Warburg 效應，癌細胞的主要代謝特征)，加速Myc 誘導的淋巴瘤發(fā)生[7]。轉化生長因子-β激活激酶1(TAK 1)是AMPK的上游活化因子，敲除TAK 1可抑制AMPK活化，導致小鼠自發(fā)肝纖維化和肝癌[8]。二甲雙胍是AMPK的激活劑，長期服用二甲雙胍的肝硬化患者肝癌發(fā)生率明顯降低[9]。同時，AMPK還是治療纖維化疾病的重要靶點，AMPK激活后可抑制肝星狀細胞和巨噬細胞增殖，減輕硫代乙酰胺(TAA)誘導的小鼠肝纖維化[10]。ZHENG等[5]發(fā)現p-AMPK低表達是肝癌預后不良的獨立危險因素。有研究結果表明，p-AMPK發(fā)揮了抑制肝纖維化和抑制腫瘤發(fā)生的雙重作用。

雖然目前已發(fā)現大量與肝癌預后相關的分子標志物，包括蛋白、lncRNA、miRNA等，但預測肝硬化向肝癌惡性轉化的分子標志物卻鮮見報道，其主要原因主要包括以下幾點：(1)因肝癌發(fā)生率低，因此統(tǒng)計學上需要大量的肝硬化組織標本；(2)肝癌的發(fā)生是一個漸進的過程，臨床上很難判斷出肝癌發(fā)生的準確時間節(jié)點；(3)肝硬化患者僅有一小部分接受手術治療，故肝硬化組織標本的獲取非常困難。本研究共收集了來自重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院和四川大學華西醫(yī)院的共557份肝硬化組織標本，經過長時間的隨訪獲得了肝癌發(fā)生相關的臨床數據，首次發(fā)現p-AMPK具有預測肝硬化患者肝癌發(fā)生的作用，可作為預測肝癌發(fā)生的潛在分子標志物。

本研究尚有以下不足之處：(1)HBV導致的肝硬化分別占重醫(yī)隊列的85.7%、華西隊列的100.0%，且均為需要通過手術預防或治療上消化道出血的患者，即所有患者均為失代償期肝硬化，研究的結果是否可應用于其他病因所導致的肝硬化或者代償期肝硬化患者仍需進一步探討；(2)因臨床上很難判斷出肝癌發(fā)生的準確時間節(jié)點，筆者也無法獲得肝癌發(fā)生的準確時間節(jié)點，但本研究嚴格納入每3～6個月規(guī)律隨訪的患者進行分析，將肝癌發(fā)生的時間鎖定在3～6個月內，獲得了一個相對準確的肝癌發(fā)生數據。

本研究結果顯示，p-AMPK的表達與糖尿病、上消化道出血和Child-Pugh B或C級有關，Fine and Gray模型分析提示，p-AMPK的表達水平與肝硬化-肝癌惡性轉化呈負相關，多因素回歸分析顯示，p-AMPK低表達是肝硬化-肝癌惡性轉化的獨立危險因素。提示AMPK可能在肝硬化-肝癌惡性轉化中扮演關鍵角色，可作為預測肝硬化-肝癌惡性轉化的潛在分子標志物。