何逸菲 唐卓菲 黃昕怡 顏 勁 吳朱杰KABORE Marthur Fabrice 孫立夫 張艷華

(紹興文理學院 生命科學學院，浙江 紹興 312000)

高等植物與土壤真菌常形成互利共生的菌根[1]，杜鵑花科(Ericaceae)植物具有特殊的杜鵑花類菌根(歐石楠類菌根ericoid mycorrhiza，ERM)，在土壤礦化率低、營養(yǎng)貧瘠的惡劣生境條件下能促進宿主對營養(yǎng)元素，尤其是氮(N)和磷(P)的吸收[2-3].然而，隨著工農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展，全球的N沉降逐漸增多[4]，N沉降的加劇使得生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)發(fā)生了極大的改變.杜鵑花科植物在N豐富的條件下生長緩慢，甚至不生長[5-6]，高水平的N沉降使荷蘭和部分英國歐石楠荒地的優(yōu)勢種由原來的杜鵑花科植物向草本植物方向演替[7]，但是P缺乏減緩了演替過程[8].植物凋落物是森林土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分的主要來源，也是植物與土壤間C、N循環(huán)的重要途徑[9]，決定著土壤有機N庫的大小[10].營養(yǎng)元素特別是P的有效性對調(diào)節(jié)植物凋落物分解速率和生態(tài)系統(tǒng)平衡具有重要作用[11].在陸地生態(tài)系統(tǒng)中，N、P和凋落物的輸入不僅能導致地上植物群落發(fā)生演替，也是地下根部真菌群落演替的驅(qū)動力.

杜鵑花科植物長期適應(yīng)貧瘠的生長環(huán)境，養(yǎng)分增加對其根部真菌侵染和ERM真菌群落是否產(chǎn)生影響還知之甚少.本文以盆栽杜鵑花科的藍莓為研究對象，通過設(shè)置不同N、P和凋落物濃度梯度，經(jīng)過培養(yǎng)，收集不同處理下藍莓的毛根，比較其根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu).并通過生態(tài)化學計量學特征的研究，建立藍莓菌根真菌多樣性與土壤營養(yǎng)元素之間的關(guān)系，探索N、P和凋落物對藍莓根部真菌群落的影響，以期為養(yǎng)分增加對藍莓等杜鵑花科植物及其根部真菌群落動態(tài)影響的研究提供一定的理論依據(jù).

1 研究方法

1.1 樣品培養(yǎng)與采集

在紹興文理學院的溫室中培養(yǎng)具有代表性的ERM植物——越橘屬(Vaccinium)的藍莓(組培的3年生苗木)，通過施加不同濃度梯度的N、P養(yǎng)分、不同質(zhì)量的杜鵑花植物的葉片凋落物(NH4Cl-N分別為10、50和120 kg N/hm2·a，NaH2PO4-P分別為10、30和50 kg P/hm2·a，以毛杜鵑葉片作為凋落物分別為0.5、1和2 kg/m2·a)，以及中倍量的N與L、N與P混合處理，4個月后各選取3個樣株，共采集藍莓毛根樣品和土壤樣品各36個.

1.2 樣品的處理及分析

1.2.1 藍莓根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)

采集藍莓植株毛根，經(jīng)過一系列處理后，進行DNA提取，PCR擴增，電泳檢測擴增產(chǎn)物，并確定有擴增產(chǎn)物的DNA樣品，低溫保存，送至生物公司待測，Illumina Miseq PE250/PE300測序：每樣品PCR產(chǎn)物大小在300～500 bp，引物為ITS1F-ITS2R.數(shù)據(jù)抽平后，每個樣本均有51 462條reads[12].

1.2.2 元素含量測定

將土壤烘干、研磨、過篩.精確稱取樣品0.5 g，硝化處理后，在比色管中加雙蒸水定容至10 mL，用美國利曼Prodigy XP型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-AES)測定樣品中P、K、Mg、Mn和Cu元素的含量.精確稱取樣品15 mg，錫箔紙包埋后，用Vario ELⅢ元素分析儀測定C和N的含量，并計算C/N和N/P.

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 13.0呈現(xiàn)，SPSS 22.0進行方差分析，r軟件包進行分析及繪圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同養(yǎng)分處理下土壤中各元素含量的比較

將測量和計算后的部分元素含量和C/N列于表1.

由表1可知，與對照組相比，添加不同濃度N的土壤中Cu含量和C/N都有顯著差異(p≤0.05)，P含量有極顯著差異(p≤0.01)；添加不同濃度P的土壤中，P和Mn含量都有顯著差異(p≤0.05)；添加不同計量凋落物的土壤中，只有K含量有顯著差異(p≤0.05)，其余元素含量之間均無顯著差異(p>0.05).

添加N、P、凋落物和NP、NL混加的處理組的P、K、Mg、Mn和Cu含量都高于對照組.說明藍莓生長過程中需要適當添加養(yǎng)分，對土壤中元素含量的保持有利.

2.2 不同養(yǎng)分處理下藍莓根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)

將高通量測序檢測結(jié)果的分類學信息進行綜合，與真菌基因庫比對后發(fā)現(xiàn)，所有處理組的真菌分屬于4個門，即Ascomycota、Basidiomycota、Mortierellomycota和unclassified_k_Fungi(未被鑒定的真菌).添加P和凋落物的藍莓根部真菌群落的組成中目、科、屬、種各分類水平的數(shù)目均比其他處理組高出2～3倍.由Venn圖1可知，CK、P、凋落物和N處理組的藍莓根部的操作分類單元OTU(Operational Taxonomic Units，相似水平≥97%)分別為59、140、188和81，而共有的OTU為30，其中凋落物和P處理組的特有真菌種類更多，分別為89和46.用Alpha豐度指數(shù)和多樣性指數(shù)進行分析，sobs、chao和ace豐度指數(shù)顯示，添加的凋落物越高，藍莓根部真菌群落的豐度越高，而N和P的濃度越高，真菌群落的豐度越低.由shannon和simpson多樣性指數(shù)可知高N、高L、中P處理組真菌多樣性更高.總體而言，凋落物的添加和NP混合添加對藍莓根部真菌的多樣性具有更明顯的促進作用.與同屬的野生越橘屬植物根部真菌相比，盆栽的藍莓根部真菌物種多樣性水平不高,僅有346個OTU，如Vacciniumcarlesii5 595 個OTU[12]和V.mandarinorum1 216個OTU[13].

表1 養(yǎng)分增加后土壤中各元素的變化

以藍莓根部真菌群落中目水平的物種構(gòu)建真菌群落結(jié)構(gòu)見圖2，僅高L1、高L2、高N3和低P3樣本主要是由Sebacinales和GS34組成，其余各組均主要由Archaeorhizomycetales和Sebacinales組成，說明不同養(yǎng)分添加，短期內(nèi)各處理組的根部真菌群落的結(jié)構(gòu)在目水平上都具有較高的相似性.用主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，對3個高倍量處理組和對照組的OTU水平進行分析，見圖3.主成分PC1和PC2分別為67%和14.69%，高倍量N、P、凋落物和對照組之間的OTU組成和結(jié)構(gòu)差異明顯，在第一主成份中高倍量N和凋落物與高倍量P和CK有明顯區(qū)分，說明添加不同的元素，藍莓植株的菌根生長過程中共生有不同的真菌；第二主成分中，高倍量N和凋落物之間并未明顯劃分，說明這兩者添加后根部菌根共生的真菌相似性很高.營養(yǎng)元素和凋落物的添加會適當改變藍莓根部內(nèi)生菌的組成和結(jié)構(gòu).這種作用在較短的時間內(nèi)有顯現(xiàn)，長期作用的效果還需進一步觀察和檢測.

圖1 各處理的藍莓植株根部真菌OTU(CK：對照組；N、L、P：分別添加N、L、P)

圖2 各處理組根部真菌群落組成(目水平)

圖3 藍莓根部真菌群落(OTU水平)組成的排序圖

2.3 藍莓根部真菌與土壤因子之間的關(guān)系

將各處理的藍莓根部真菌豐度排前30的OTU與土壤元素含量和元素計量比進行spearman相關(guān)性分析，結(jié)果見圖4.公認的ERM真菌的有4個，其中OTU11為子囊菌的Oidiodendronmaius[14-15]與Mn呈顯著正相關(guān)，其他3個即OTU22、OTU31和OTU33都是擔子菌的Sebacinales真菌目的成員，與多種元素含量呈顯著或極顯著負相關(guān)，Sebacinales的部分成員在全球范圍內(nèi)杜鵑花植物根中普遍存在[16-18].說明土壤中營養(yǎng)元素含量高不利于其ERM功能性真菌的定殖.

將土壤元素和元素計量比與中等水平處理的各組和對照組藍莓樣本及其根部真菌群落(豐度前30的OTU)進行冗余分析RDA(Redundancy analysis)，即環(huán)境因子約束化的主成分分析，見圖5，中N處理的藍莓樣本和真菌群落都與N/P呈正相關(guān)，中N和中NL樣本都與K、Mg、Mn和C/N都呈負相關(guān)，而中P和中NP的樣本和真菌群落都與C、N和N/P呈負相關(guān)，從圖5可以看出，除P元素外其他的土壤元素含量和元素計量比的影響都比較大.中等水平的凋落物處理組和CK組的各樣本和真菌群落沒有明顯的相關(guān)性.進一步說明不加養(yǎng)分或者是仿照自然生態(tài)系統(tǒng)僅添加凋落物(緩慢分解釋放的養(yǎng)分)可能更加有利于藍莓根部真菌群落的建立，全球N沉降可能是導致杜鵑花科植物的菌根真菌減少，進而發(fā)生地上部分衰退的一個重要原因.

圖4 Spearman相關(guān)性熱圖(*0.01

圖5 土壤因子、真菌群落和樣本之間的關(guān)系

3 結(jié)論

養(yǎng)分增加對藍莓根部真菌群落的組成和結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生影響，添加凋落物的處理組根部真菌豐度最高，而添加N和P越多，真菌群落的豐度越低；公認的ERM真菌Oidiodendronmaius與Mn呈顯著正相關(guān)，而Sebacinales與多種元素含量，特別是P呈顯著或極顯著負相關(guān)；RDA分析顯示僅添加凋落物或者不添加養(yǎng)分的藍莓根部真菌群落與土壤主要元素和元素計量比沒有相關(guān)性.總之，加N和加P不利于藍莓根部物種豐富度的增加和ERM功能性真菌在群落中的建立.