宮江寧，吳 婕，熊 亞

(1.貴州師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550018)

0 引言

梔子為一種具有藥食兩用的傳統(tǒng)中藥，是茜草科植物梔子成熟干燥的果實(shí)，具有解毒利尿涼血、瀉火清心除煩的作用，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在《本草綱目》中也有大量的記載。世界上總共有大約250種，主要栽培在我國中南地區(qū)，國外主要分布在東南亞、東亞、南亞、北美等地[1-2]。

梔子多糖為從梔子果實(shí)中提取的一種水溶性多糖。多糖的提取可采用熱水、堿、酸和乙醇等作為提取溶劑，提取方法主要有浸提法、酶法、超聲法、微波法、超臨界CO2萃取等[3]。試驗(yàn)表明植物多糖通常具有很多的生物活性，如多糖有抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]、降血脂[7]、抑菌[8]、降血糖[9]等作用。目前對梔子的研究主要集中在梔子黃色素[10-12]，梔子甙[13-15]，梔子黃酮[16]等成份的研究，對梔子多糖的研究相對較少。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，Box-Behnken模塊試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種常用的方法，可根據(jù)試驗(yàn)考察因素和考察指標(biāo)之間的關(guān)系建立數(shù)學(xué)模型，并自動(dòng)分析，從中可判斷出試驗(yàn)和模型結(jié)果的擬合度，還可考察因素之間的交互作用及對考察指標(biāo)的影響等，廣泛用于天然產(chǎn)物成份的提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)中[17-20]。本試驗(yàn)以梔子為原料，研究超聲提取工藝中超聲時(shí)間、液料比、超聲功率對梔子多糖提取率的影響。并利用響應(yīng)面法對其提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到梔子多糖的最佳提取條件。并對梔子多糖的抗氧化活性和降血糖能力進(jìn)行研究，以期為梔子多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子：重慶帛霖藥業(yè)；1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展公司；氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate acid), ABTS)：上海源葉生物科技；α-葡萄糖苷酶：Sigma公司；4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)：Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

A200S型電子天平：德國賽多利斯集團(tuán)；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FZ102型微型植物粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；UV2300分光光度計(jì)：上海天美科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梔子多糖的提取

將洗凈的梔子干燥粉碎，加入80%乙醇浸泡2 h，以脫去部分色素、油脂、單糖和小分子物質(zhì)，過濾并干燥備用[21]。稱取10 g梔子粉末，加入蒸餾水，用超聲波法提取一定時(shí)間，先用藥篩過濾，再減壓過濾，收集濾液并減壓濃縮，再向濃縮液中加入乙醇，使乙醇的濃度為80%，放入冰箱中沉淀24 h。過濾，并依次用無水乙醇和丙酮清洗多糖沉淀，所得沉淀自然風(fēng)干，得到梔子多糖。

(1)

1.3.2 梔子多糖提取的單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.3.1中的試驗(yàn)方法，分別考察不同的超聲時(shí)間(10 min、40 min、70 min、100 min)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)、超聲功率(60 W、90 W、120 W、150 W)對梔子多糖提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在1.3.2中單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取提取時(shí)間(X1)、液料比(X2)、功率(X3)這3個(gè)因素，以梔子多糖的提取率(Y)作為響應(yīng)值，運(yùn)用3因素3水平的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)，對梔子多糖的超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，因素水平表見表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels graph

1.3.4 梔子多糖的活性

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對多糖提取率的影響

考察不同超聲提取時(shí)間(10 min、40 min、70 min、100 min)對梔子多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1所示。

圖1 超聲時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.1 Effects of extraction time on the yield of polysaccharides

由圖1可以看出，超聲時(shí)間在10～70 min內(nèi)，梔子多糖提取率呈顯著增加并達(dá)到峰值5.26%，而當(dāng)時(shí)間超過70 min時(shí)，提取率反而減小，所以選擇提取時(shí)間為70 min。這可能是由于提取時(shí)間過短，多糖不能充分從梔子藥粉內(nèi)部向周圍溶劑里擴(kuò)散，所以隨著超聲時(shí)間的延長，提取率逐漸提高并達(dá)到峰值。但超聲時(shí)間繼續(xù)延長，多糖逐漸分解，所以提取率反而降低[32]。

2.1.2 液料比對多糖提取率的影響

考察不同液料比(mL/g)(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)對梔子多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對梔子多糖提取率的影響Fig.2 Effects of water-material ratio on the yield of polysaccharides

由圖2可以看出，梔子多糖提取率隨著液料比的增加而增加，但當(dāng)液料比大于40∶1后，提取率增加的趨勢減緩。說明液料比增大能充分地將有效成份提取出來，使植物細(xì)胞內(nèi)部與外部溶劑間產(chǎn)生較大的濃度差，用水來提取梔子多糖的過程，實(shí)際上是梔子中的多糖向水中擴(kuò)散的過程，當(dāng)溶劑的用量增加，有利于多糖的擴(kuò)散速度，多糖分子的溶出率也會提高[33-34]，并逐漸會達(dá)到平衡的狀態(tài)，從圖2中可以看出在40∶1附近梔子多糖達(dá)到了平衡態(tài)。所以選擇液料比為40∶1(mL/g)。

2.1.3 功率對多糖提取率的影響

考察不同超聲功率(60 W、90 W、120 W、150 W)對梔子多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 功率對梔子多糖提取率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the yield of polysaccharides

由圖3可以看出，梔子多糖提取率隨著功率的增加，先呈現(xiàn)增加的趨勢，當(dāng)功率為120 W時(shí)，提取率達(dá)到最大，為6.32%。但超過120 W后，提取率反而略有減小。這可能是由于功率太大，梔子多糖容易造成分解而使提取率減小[35]。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，利用Design Expert 10軟件對表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對各因素回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸方程為：

Y=6.28+0.020X1+0.19X2+0.15X3+0.045X1X2-0.030X1X3-0.090X2X3-0.19(X1)2-0.24(X2)2-0.36(X3)2

該回歸模型中的一次項(xiàng)X2和二次項(xiàng)X22﹑X32對提取率的影響極顯著，二次項(xiàng)X12和一次項(xiàng)X3對提取率的影響顯著。各因素之間的交互作用不大，各因素對多糖提取率的影響大小順序?yàn)椋禾崛r(shí)間液料比(X2)>功率(X3)>提取時(shí)間(X1)。

表2 Bex-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Bex-Behnken design with experimental result

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面最優(yōu)結(jié)果

曲線的走勢越陡，說明該因素對梔子多糖的提取率影響越大，而曲線的走勢越平緩則說明該因素對梔子多糖提取率的影響較小[36]。從圖4可以看出，對梔子多糖提取率影響最大的因素是料液比，其次是功率和提取時(shí)間，這和表3中的分析結(jié)果相一致。由回歸模型預(yù)測的梔子多糖最佳提取工藝條件為提取時(shí)間為72.55 min，液料比為43.63∶1(mL∶g)，功率為124.64 W，最大提取率預(yù)測值為6.33%。為了方便操作，將優(yōu)化的條件改為提取時(shí)間為73 min，液料比為44∶1(mL∶g)，功率為120 W，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，梔子多糖的提取率為(6.34±0.09)%，這和預(yù)測值較接近，因此該模型可較好地預(yù)測和模擬梔子多糖的產(chǎn)率及最佳的提取工藝。

圖4 各因素交互影響多糖得率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot for the mutual effects of three variables on yield of polysaccharides

2.3 梔子多糖的活性

2.3.1 梔子多糖對ABTS+·的清除作用

梔子多糖對ABTS+·的清除能力見圖5，從圖5中可以看出隨著梔子多糖的加入量的增多，清除率也隨之增大，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。以梔子多糖濃度(5～2 000 mg/mL)和維生素C濃度(5～40 mg/L)對ABTS+·的清除率做擬合，其相關(guān)系數(shù)均大于0.9，得到梔子多糖的IC50為1 210 mg/L，維生素C的IC50為20 mg/L，表明梔子多糖對ABTS+·有一定的清除能力，但其清除效果小于同濃度的維生素C。

圖5 梔子多糖清除ABTS+·的能力Fig.5 Scavenging effect of polysaccharide from Gardeniae on ABTS+·

2.3.2 梔子多糖對DPPH·清除作用

梔子多糖對DPPH·清除能力見圖6，由圖6中可以看出隨著梔子多糖加入量的增多，清除率也隨著增大，且濃度超過500 mg/L以后，清除率增大的趨勢開始減緩，維生素C濃度大于500 mg/L以后，對DPPH·清除作用的清除率基本沒有變化，已達(dá)到了最大清除率。以梔子多糖濃度(5～10 000 mg/L)和維生素C濃度(5～100 mg/L)對DPPH·的清除率做擬合，其相關(guān)系數(shù)均大于0.9，得出梔子多糖的IC50為430 mg/L，維生素C的IC50為46 mg/L。由清除率的趨勢和IC50值可以看出，梔子多糖對DPPH·有一定的清除能力，而維生素C對DPPH·的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于梔子多糖。

圖6 梔子多糖清除DPPH·的能力Fig.6 Scavenging effect of polysaccharide from Gardeniae on DPPH·

2.3.3 梔子多糖對OH·的清除作用

梔子多糖對OH·清除能力見圖7，由圖7中可以看出隨著梔子多糖加入量的增多，清除率也增大，維生素C對OH·的清除能力略高于梔子多糖。以梔子多糖濃度(5～10 000 mg/L)和維生素C濃度(5～500 mg/L)對OH·的清除率做擬合，得出梔子多糖的IC50為310 mg/L，維生素C的IC50為240 mg/L。表明梔子多糖對OH·有一定的清除能力，且清除效果與同濃度的維生素C相當(dāng)。

圖7 梔子多糖清除OH·的能力Fig.7 Scavenging effect of polysaccharide from Gardeniae on OH·

圖8 梔子多糖清除的能力Fig.8 Scavenging effect of polysaccharide

2.3.5 梔子多糖總還原能力

從圖9可以看出梔子多糖和維生素C的總還原能力與樣品濃度的量效關(guān)系。濃度增高，梔子多糖和維生素C的總還原能力均為升高的趨勢，但梔子多糖的總還原能力小于同濃度的維生素C。當(dāng)維生素C的濃度為10 000 mg/L時(shí)，吸光度已經(jīng)達(dá)到3.015，而梔子多糖的吸光度只有1.18。

圖9 梔子多糖的總還原能力Fig.9 Reducing power of polysaccharides from Gardeniae

2.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

以阿卡波糖作為陽性對照，檢測梔子多糖的降血糖活性，結(jié)果如圖10。由圖10可以看出，隨著梔子多糖添加濃度的提高，對α-葡萄糖苷酶抑制也隨之提高，當(dāng)多糖濃度大于8 000 mg/L時(shí)，抑制率的增加趨勢變緩。當(dāng)多糖濃度范圍在2 000～8 000 mg/L內(nèi)，濃度和抑制率呈現(xiàn)一定的線性關(guān)系，回歸方程為y=6.541 8x+39.867(R2=0.999 9)，算出其IC50值為1 550 mg/L。這表明梔子多糖具有一定抑制糖吸收的功效，但與阿卡波糖相比，梔子多糖的降糖活性弱于陽性對照?？傮w上梔子多糖具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

圖10 梔子多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.10 Inhibition rate of polysaccharides from Gardenia on α-glucosidase

3 結(jié)論

采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)對梔子多糖的提取工藝優(yōu)化方案可行。優(yōu)化的工藝參數(shù)為：提取時(shí)間為73 min，液料比為44∶1(mL/g)，功率為120 W，在此條件下，梔子多糖的提取率為(6.34±0.09)%，驗(yàn)證的試驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)化工藝可行。