林曉暉 張捷平 陳 勇 鄭燕芳 施 紅
(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福建福州 350122)
隨著城市化、老齡化以及生活方式的改變等,2 型糖尿?。═2DM)患病率逐年增高,已經(jīng)發(fā)展成為我國常見的內(nèi)分泌代謝性疾病[1]。T2DM 后期并發(fā)癥致殘、致死率高,消耗巨大的醫(yī)療資源,給患者和社會造成了極大負擔(dān)。越來越多研究表明[2],由炎癥因子介導(dǎo)的慢性低度炎癥引發(fā)胰島素抵抗,是T2DM 發(fā)病的重要原因,但其機制復(fù)雜。其中腸道菌群失調(diào)、腸道屏障功能受損,導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)中來自于革蘭氏陽性菌細胞壁的脂多糖(LPS)水平升高,從而激活Toll 樣受4(TLR4)信號通路,使血漿和組織促炎因子,如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等水平增加,是導(dǎo)致慢性低度炎癥及誘發(fā)胰島素抵抗的重要機制之一[3]。前期研究表明,以石斛合劑基本方(現(xiàn)為福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑)為基礎(chǔ),依從滋陰清熱、益氣活血、清肝泄?jié)岱ǖ氖蟿┬蜇灧?,在治療T2DM 及其并發(fā)癥,糾正T2DM 的糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗等方面具有很好的療效[4-5]。本實驗旨在研究石斛合劑序貫療法對糖尿病小鼠血清中LPS 水平、相關(guān)炎癥指標及整體水平糖代謝的影響,從而分析其治療糖尿病的可能機制。
db/db 小鼠18 只,平均體質(zhì)量(44.6±3.5)g,db/m 小鼠6 只,平均體質(zhì)量(23.6±1.5)g,均為12 ~ 13 周齡的無特定病原體動物(Specific pathogen Free,SPF)級雄性小鼠,由北京大學(xué)(醫(yī)學(xué)部)實驗動物科學(xué)部提供,許可證號:SCXK(京)2011-0012,于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF 級環(huán)境中飼養(yǎng)。實驗期間,喂以普通飼料,自由飲水,環(huán)境溫度20 ~ 23 ℃,相對濕度 55% ~70%,12 h 光照,晝夜循環(huán)。
石斛合劑1 號方(石斛15 g,黃芪20 g,五味子8 g,丹參20 g,葛根15 g,生地黃18 g,玄參10 g,知母12 g),石斛合劑2 號方(茵陳18 g,大黃3 g,梔子10 g,柴胡6 g,萹蓄15 g,甘草6 g),購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院。采用常規(guī)水煎2 次后合并,過濾濃縮成含藥量1.2 g/mL 的藥液。二甲雙胍緩釋片配制濃度為20 mg/mL。
小鼠胰島素(Ins)ELISA 試劑盒(YX-061899R)、小鼠脂多糖(LPS)ELISA 試劑盒(YX-064351R)、小鼠白介素-6(IL-6)ELISA 試劑盒(YX-039315R)、小鼠白介素-10(IL-10)ELISA 試劑盒(YX-033912R)均購自北京議達成科技有限公司;糖化血清蛋白(GSP)測定試劑盒(果糖胺法,A037-1,20180718)購自南京建成生物技術(shù)公司;ELx800 型酶標儀購自美國Bio-Tek 公司。
1.3.1 分組及給藥
db/db 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后,選取空腹血糖(FBG)≥11.1 mmoL/L 為糖尿病模型鼠,按FBG 和體質(zhì)量隨機分成三組:分別為模型組、石斛合劑序貫組(以下簡稱序貫組)和二甲雙胍組,每組6 只。再取6 只同周齡表型正常的db/m 小鼠為正常對照組(以下簡稱正常組)。以上4 組小鼠灌胃給藥,1次/d。其中,序貫組給予1號方12 g/(kg·d)連續(xù)4 d,再續(xù)以2 號方12 g/(kg·d)連續(xù)3 d 為1 個療程,每個療程之間停藥1 d,連續(xù)給藥8 個療程(64 d);二甲雙胍組給予二甲雙胍0.2 g/(kg·d);正常組和模型組給予生理鹽水10 mL/(kg·d)。各組小鼠每周稱重1 次,根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥液的灌胃體積。
1.3.2 血清學(xué)指標測定
分別在干預(yù)前及干預(yù)后2、4、6、8 個療程,禁食不禁水10 h,采用割尾法取血,血糖儀檢測各組小鼠的空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)BG);干預(yù)8 個療程(64 d)后,摘眼球取血,分離收集各組小鼠的空腹血清,采用果糖胺法測定血清GSP 含量,采用ELISA 法測定血清胰島素(fasting serum insulin,F(xiàn)INS)、脂多糖(LPS)、白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)的含量。計算胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR,計算公式:HOMA-IR=FBG(mmoL/L)×FINS(mU/L)/22.5[6]。
實驗數(shù)據(jù)采用 SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以(±s)表示,采用t 檢驗。計數(shù)資料以[例(%)]表示,采用χ2檢驗。P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
干預(yù)前模型組、序貫組與二甲雙胍組的FBG 均顯著高于正常組(P <0.01),但模型組、序貫組二甲雙胍組三組FBG 比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。從干預(yù)4 個療程開始,序貫組與二甲雙胍組的FBG 較模型組顯著下降(P <0.05),二甲雙胍組的FBG 與干預(yù)前比較也顯著下降(P <0.05)。
干預(yù)8 個療程后,序貫組與二甲雙胍組的FBG 均比模型組顯著下降(P <0.01),序貫組與二甲雙胍組的FBG與干預(yù)前比較均顯著下降(P <0.05),見表1。
表1 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠FBG 的影響(±s,mmol/L)
表1 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠FBG 的影響(±s,mmol/L)
注:與正常組比較,*P <0.01;與模型組比較,#P <0.05,▲P <0.01;與本組干預(yù)前比較,●P <0.05,★P <0.01。
組別 n 干預(yù)前 2個療程 4個療程 6個療程 8個療程正常組 6 5.85±0.67 5.95±0.75 5.72±0.78 6.00±0.70 6.05±0.74模型組 6 18.78±3.05* 18.95±2.60* 20.30±2.29* 21.05±1.91* 22.42±2.16*序貫組 6 19.03±3.62* 18.45±1.98* 17.25±1.91*# 16.87±3.43*# 15.80±2.14*▲●二甲雙胍組 6 18.97±3.06* 17.67±3.73* 15.75±2.97*▲● 13.88±2.52*▲★ 13.32±2.46*▲★
干預(yù)8 個療程后,模型組血清GSP、FINS 和HOMAIR 均顯著高于正常組(P <0.01),表明db/db 小鼠長期處于高血糖、高胰島素血癥及高胰島素抵抗狀態(tài)。與模型組相比,序貫組和二甲雙胍組血清GSP(P <0.01)、FINS(P <0.01)及HOMA-IR(P <0.01)均顯著降低。序貫組和二甲雙胍組在干預(yù)結(jié)束后GSP 含量與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),見表2。
干預(yù)8 個療程后,模型組的LPS、IL-6 均高于正常組(P <0.01),IL-10 低于正常組表明db/db 小鼠處于內(nèi)毒素血癥及慢性炎癥狀態(tài)。與模型組相比,序貫組和二甲雙胍組血清LPS 水平均顯著降低兩組血清LPS 水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.01);序貫組和二甲雙胍組血清IL-6 水平與模型組比較均顯著降低(P <0.01),但序貫組和二甲雙胍組血清IL-6 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05);序貫組和二甲雙胍組均顯著升高血清IL-10水平與模型組比較(P <0.01),膽序貫組和二甲雙胍組血清IL-10 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),見表3。
表2 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠GSP、FINS 和HOMA-IR 的影響(±s)
表2 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠GSP、FINS 和HOMA-IR 的影響(±s)
注:與正常組比較,*P <0.01;與模型組比較,#P <0.01。
組別 n GSP(mmol/L) FINS(mU/L) HOMA-IR正常組 6 3.83±0.24 22.24±4.59 6.05±1.46模型組 6 5.30±0.40* 62.62±4.53* 62.52±9.52*序貫組 6 4.03±0.69# 43.76±2.45*# 31.34±5.97*#二甲雙胍組 6 3.95±0.30# 37.01±2.77*# 22.91±4.25*#
表3 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠LPS、IL-6 和IL-10 的影響(±s)
表3 石斛合劑序貫法對db/db 小鼠LPS、IL-6 和IL-10 的影響(±s)
注:與正常組比較,*P <0.01;與模型組比較,#P <0.01;與序貫組比較,▲P <0.01。
組別 n LPS(EU/L) IL-6(pg/mL) IL-10(pg/mL)正常組 6 566.43±39.88 127.43±10.31 561.89±71.73模型組 6 981.48±93.40* 294.35±17.58* 171.19±39.04*序貫組 6 762.88±45.46*# 241.40±14.53*# 498.38±61.74#二甲雙胍組 6 665.08±45.71*#▲238.94±10.75*# 534.49±62.35#
T2DM 作為糖尿病的主要類型,患者以高血糖為顯著特征,常伴隨著肥胖和胰島素抵抗。糖尿病在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴”的范疇,主要由飲食不節(jié)、情志不調(diào)、先天稟賦不足等各種因素引起,任其發(fā)展,多表現(xiàn)為氣陰兩虛,夾雜痰濁、濕熱、瘀血阻于脈絡(luò)。本研究采用的是施紅教授 “滋陰益氣、活血泄?jié)帷钡氖蟿┬蜇灧āJ蟿┬蜇灧街校? 號方滋陰清熱、益氣活血,2 號方清肝利濕泄?jié)?。兩方依序反?fù)交替、循環(huán)治療,稱為石斛合劑序貫法[6-8]。前期研究表明,石斛合劑序貫法在臨床上可以明顯改善T2DM 患者燥熱、煩渴、盜汗等癥狀,顯著降低血糖、調(diào)節(jié)血脂等。基礎(chǔ)研究中,石斛合劑及其序貫法亦能保護糖尿病模型鼠的胰腺組織、糾正糖脂代謝異常癥狀、抗氧化及降低炎癥蛋白表達和釋放等,并能延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[9]。
本研究選用的糖尿病模型鼠db/db 小鼠是從瘦素受體基因缺陷的C57BL / Ks 小鼠中篩選而來的突變系,表現(xiàn)為肥胖、高血糖、高胰島素血癥等代謝異常,常并發(fā)糖尿病微血管病變,是研究人類T2DM 理想的動物模型。由于db/db小鼠的瘦素受體基因缺陷,瘦素信號通路障礙,進而影響其對胰島素分泌的抑制作用,胰腺β 細胞持續(xù)分泌胰島素,引發(fā)高胰島素血癥。通過糖代謝相關(guān)血清學(xué)指標的檢測表明,本實驗研究結(jié)果與以往研究報道一致[10],db/db小鼠與對照組db/m 小鼠相比,表現(xiàn)出高血糖、高胰島素及胰島素抵抗等癥狀。通過石斛合劑序貫法進行干預(yù)治療后,db/db 小鼠的空腹血糖(FBG)逐漸下降,從第4 個療程開始,與模型組有顯著差異;治療8 個療程后,序貫組的FBG 與模型組的差異更加明顯,但與二甲雙胍組無顯著差異。經(jīng)過8 個療程的干預(yù),序貫組的血清空腹胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)均比模型組有顯著降低,表明胰島素抵抗狀態(tài)得到緩解。
糖化血清蛋白(GSP)是血清中的葡萄糖與血清蛋白之間形成的高分子酮胺化合物。由于血清蛋白半衰期較血紅蛋白短,該指標可以反映檢測前3 周內(nèi)平均血糖水平,且不受臨時血糖波動的影響,可用于觀測近期血糖控制的情況[11]。本研究中,模型組GSP 顯著高于正常組,表明db/db 小鼠存在持續(xù)性高血糖的狀態(tài),而序貫組經(jīng)過8個療程的干預(yù)治療,GSP 含量比模型組顯著降低,但與正常組及二甲雙胍組無顯著差異。該結(jié)果表明,石斛合劑序貫法對穩(wěn)定平均血糖水平發(fā)揮重要作用,干預(yù)后db/db 小鼠血糖控制良好。
T2DM病因和發(fā)病機制復(fù)雜。越來越多的研究表明[12],由炎癥因子介導(dǎo)的慢性低度炎癥是糖尿病的發(fā)病及持續(xù)進展的重要原因。其中腸道微環(huán)境的改變與慢性低度炎癥密切相關(guān),由于腸道屏障功能受損而導(dǎo)致循環(huán)系統(tǒng)中來自于革蘭氏陽性菌細胞壁的脂多糖(LPS)水平升高。LPS可通過LPS-TLR4 / NF-kB 信號通路,促進炎性細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1 等的表達與釋放。后者通過損傷參與糖脂代謝調(diào)節(jié)的重要器官(如胰腺、肝、腎等)的靶細胞,最終引起T2DM 的胰島素抵抗及肥胖。IL-10 是一種重要的抗炎細胞因子,作為微生物抗原免疫應(yīng)答的負調(diào)節(jié)因子發(fā)揮著重要作用。它能抑制巨噬細胞的活化,從而抑制其表達釋放炎性細胞因子,發(fā)揮抗炎的功效[13]。本研究中,模型組LPS和IL-6均高于正常組,而IL-10水平低于正常組,表明db/db 小鼠處于內(nèi)毒素血癥和慢性低度炎癥的狀態(tài)。而經(jīng)過8 個療程的干預(yù)治療,與模型組相比,序貫組的LPS和IL-6 水平降低,而IL-10 水平升高。該結(jié)果表明石斛合劑序貫法可以有效降低糖尿病小鼠的炎癥反應(yīng),具有一定的抗炎作用。
綜上所述,石斛合劑序貫法能夠降低db/db 小鼠的血糖水平及胰島素抵抗、緩解內(nèi)毒素血癥、有效降低糖尿病小鼠的炎癥反應(yīng)。這可能與其通過促進抗炎因子釋放、參與維持腸道穩(wěn)態(tài)、抑制內(nèi)毒素脂多糖進入血液循環(huán),從而降低糖尿病的胰島素抵抗和減弱慢性低度炎癥狀態(tài)有關(guān)。但其通過何種機制保護腸道穩(wěn)態(tài)和發(fā)揮抗炎作用,有待進一步研究。