景瑞雪 孔凡華 白沙沙 田亮 崔亞娟 劉洋

摘?要：目的：研究關(guān)鍵發(fā)育期諾麗果中主要活性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。方法：采用高效液相色譜技術(shù)分別檢測(cè)青果期、硬白果期和熟果期3個(gè)熟期的西沙諾麗果實(shí)中車葉草酸、去乙酰車葉草酸、東莨菪亭、槲皮素等活性成分及其含量。結(jié)果：車葉草苷酸、去乙酰車葉草苷酸、東莨菪亭、槲皮素均能夠在3個(gè)熟期的諾麗果實(shí)中檢測(cè)到。諾麗的熟度對(duì)主要活性物質(zhì)的含量有顯著影響，不同熟期的去乙酰車葉草苷酸、東莨菪亭和槲皮素的含量?jī)蓛芍g都差異顯著，硬白果期、熟果期與青果期的車葉草苷酸的含量差異顯著（P<0.05）。4種活性物質(zhì)的含量均隨果實(shí)的成熟而不斷增加，熟果期的4種主要活性物質(zhì)的含量分別達(dá)到58.422 7 、110.765 0、13.545 5 、0.166 2 mg/100 g，青果期到硬白果期諾麗果中上述活性物質(zhì)的含量變化較大。結(jié)論：本研究為如何在不同功能導(dǎo)向的諾麗產(chǎn)品生產(chǎn)加工過(guò)程中合理選擇不同熟度的諾麗果原材料提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：諾麗;化學(xué)成分;生長(zhǎng)期;含量測(cè)定;高效液相色譜

諾麗為茜草科巴戟天屬植物，其根、莖、葉、果實(shí)具有治療皮膚疾病、傷口感染、心臟病、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、高血壓、消化不良、口腔潰瘍等功效[1-4]。目前，本土諾麗果在中國(guó)海南、西沙群島、中國(guó)臺(tái)灣等地大量種植?，F(xiàn)代藥理學(xué)證實(shí)，諾麗果中含有多糖、酚類、蒽醌類、環(huán)烯醚萜類等功效成分，具有抗衰老、抗氧化、抗菌、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等作用[5-8]。車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸是諾麗中兩種主要環(huán)烯醚萜類活性物質(zhì)，研究表明，車葉草苷酸和去乙酰車葉草苷酸具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗畸變、保肝等藥理功效，已經(jīng)成為諾麗產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)和標(biāo)志性活性成分[9-11]。西沙諾麗果汁多酚的平均含量高達(dá)114.12 mg/100 mL，從諾麗果中分離到的多酚類物質(zhì)主要有黃酮、香豆素、木質(zhì)素等[12]。梁寒峭等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，西沙諾麗果汁中香豆素含量在0.176～0.243 mg/mL內(nèi)，并且已有報(bào)道將東莨菪素作為諾麗果汁的質(zhì)量分析方法。研究證實(shí)，東莨菪亭對(duì)脂肪合成酶、黑色素、腫瘤的生成有明顯的抑制作用，并且是諾麗果發(fā)揮抗血管生成活性的主要有效成分之一[15-17]。槲皮素具有抗氧化、降脂減肥、降血糖、抗腫瘤、抗炎癥等多種生理活性。沈宋利等[18-21]在美國(guó)關(guān)島諾麗果粉中檢測(cè)出槲皮素的含量為0.10 mg/g。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)諾麗果的衍生產(chǎn)品中化學(xué)成分的研究較多，且多集中于多糖、蒽醌、多酚、環(huán)烯醚萜等總量的提取與測(cè)量，對(duì)諾麗果原材料的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。結(jié)合以上情況，本研究以我國(guó)本土諾麗品種——西沙諾麗的果實(shí)作為研究對(duì)象，追蹤西沙諾麗果關(guān)鍵發(fā)育期主要活性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，旨在為諾麗果原材料的實(shí)時(shí)采收、質(zhì)量控制以及縮短諾麗產(chǎn)品生產(chǎn)成本與周期提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料與試劑

去乙酰車葉草苷酸對(duì)照品，純度≥98%;車葉草苷酸對(duì)照品，純度≥95%;槲皮素對(duì)照品，純度≥95%;東莨菪亭對(duì)照品，純度≥95%;乙腈、磷酸，均為色譜級(jí);乙酸、甲醇，均為分析級(jí)。

西沙諾麗果，由海南西沙諾麗生物科技有限公司于2019年9月采集與提供。

1.2?儀器與設(shè)備

戴安高效液相色譜儀U-3000，紫外檢測(cè)器;C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;BRAUN粉碎機(jī);超聲清洗儀，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;Eppendorf5420離心機(jī)。

1.3?方法

1.3.1?不同熟度諾麗果中去乙酰車葉草苷酸-車葉草苷酸含量測(cè)定?（1）配置標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取5 mg去乙酰車葉草苷酸對(duì)照品和車葉草苷酸對(duì)照品于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。（2）配置標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，進(jìn)行梯度稀釋，配置濃度為5 、10 、20、40 、80 μg/mL。（3）樣品前處理：準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品10 g于50 mL離心管中，加40 mL水混勻，超聲提取30 min后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻后離心，上清液過(guò)0.45 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。（4）色譜條件：戴安高效液相色譜儀U-3000，紫外檢測(cè)器;檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm;C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫35 ℃;流動(dòng)相：乙腈-磷酸水溶液，進(jìn)樣體積10 μL。依據(jù)表1進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖1，青果期、硬白果期、熟果期樣品色譜圖見(jiàn)圖2～4。

1.3.2?不同熟度諾麗果中槲皮素-東莨菪亭含量測(cè)定

（1）配置標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別準(zhǔn)確稱取5 mg槲皮素對(duì)照品和東莨菪亭對(duì)照品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。（2）配置標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，進(jìn)行梯度稀釋，配置濃度為5 、10 、20 、40、80 μg/mL。（3）樣品前處理：準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品10 g于50 mL離心管中，加40 mL甲醇混勻，超聲提取30 min后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻后離心，上清液過(guò)0.45 μm濾膜，上機(jī)測(cè)定。（4）色譜條件：戴安高效液相色譜儀U-3000，紫外檢測(cè)器;檢測(cè)

圖1?去乙酰車葉草苷酸-車葉草苷酸標(biāo)準(zhǔn)色譜圖波長(zhǎng)346 nm;柱溫30 ℃;乙腈-0.5%乙酸水比例為30∶70，流速1.0 mL/min，分析時(shí)間20 min，進(jìn)樣量10 μL。對(duì)照品色譜圖見(jiàn)圖5。青果期、硬白果期、熟果期樣品色譜圖見(jiàn)圖6～8。

1.3.3?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)?取同一批諾麗果樣品，上述步驟重復(fù)3次，用SPSS 25.0中One-Way ANOVA對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2?結(jié)果與分析

在諾麗果生長(zhǎng)過(guò)程中，車葉草苷酸、去乙酰車葉草苷酸、東莨菪亭和槲皮素的含量在不同的熟期差異顯著（P<0.05），說(shuō)明諾麗的熟度對(duì)4種物質(zhì)有顯著影響。并且不同熟期去乙酰車葉草苷酸、東莨菪亭和槲皮素的含量?jī)蓛芍g都差異顯著，硬白果期、熟果期與青果期的車葉草苷酸的含量差異顯著（P<0.05）。4種標(biāo)志性功效成分動(dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)相似規(guī)律，皆表現(xiàn)為青果期最少，硬白果期次之，熟果期達(dá)到峰值，含量分別為58.422 7 、110.765 0 、13.545 5 、0.166 2 mg/100 g。因此，4種標(biāo)記性功效成分含量與果實(shí)的成熟度呈現(xiàn)正相關(guān)性。但是，果實(shí)的生長(zhǎng)過(guò)程中其含量上升趨勢(shì)并非是穩(wěn)步的。其中，青果期到硬白果期的含量有一個(gè)快速增長(zhǎng)的過(guò)程，分別由青果期的11.346 3、25.037 7、2.518 0、0.000 4 mg/100 g激增至56.553 1、103.071 6、12.270 6 、0.166 2 mg/100 g，而硬白果期到熟果期的生長(zhǎng)過(guò)程中含量增長(zhǎng)較為緩慢（表2）。

3?討論

車葉草苷酸、去乙酰車葉草苷酸、東莨菪亭、槲皮素皆是植物正常生長(zhǎng)過(guò)程中的以C、H、O元素為基礎(chǔ)的次生代謝產(chǎn)物，青果期到硬白果期過(guò)程中4種活性物質(zhì)的含量激增模式可能與光合作用中積累過(guò)多的C源用于合成以C為基礎(chǔ)的次生代謝產(chǎn)物有關(guān)[22]。lin等[23]研究表明，諾麗果的體積、重量與生長(zhǎng)時(shí)間呈現(xiàn)線性增長(zhǎng)模式，且東莨菪亭的平均含量為每果干重2～3 mg，在果實(shí)生長(zhǎng)的過(guò)程中不斷積累，并呈現(xiàn)s型曲線，其含量增長(zhǎng)趨勢(shì)與本研究結(jié)果一致。劉杰超等[24]、徐貴華等[25]、杜麗娜等[26]研究表明，黃酮類化合物在棗、柑橘果實(shí)中含量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)為未成熟期積累，成熟期下降;多酚類化合物在杏果實(shí)中含量的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)為幼果期為最高，其后隨著果實(shí)的發(fā)育呈逐漸下降趨勢(shì)，皆與本研究中多酚類化合物——東莨菪亭、槲皮素的持續(xù)增長(zhǎng)模式有所不同，這與諾麗果實(shí)中與多酚等相關(guān)合成酶的活性有關(guān)。

植物的生長(zhǎng)過(guò)程中，隨著成熟度的增加，各項(xiàng)化學(xué)成分不斷變化，因此主要活性物質(zhì)的含量是判斷諾麗果是否適合采收的重要依據(jù)。國(guó)外學(xué)者采用高效液相色譜法測(cè)得成熟的大溪地諾麗果中車葉草苷酸、去乙酰車葉草苷酸的平均含量分別為3.741、1.253 mg/g，其含量高于本研究中的西沙諾麗果[27]。但是有研究稱，以我國(guó)西沙諾麗果為原材生產(chǎn)的果汁中車葉草苷酸的含量明顯高于大溪地、澳大利亞等地區(qū)[28]，這可能是由于諾麗果成熟度、采收時(shí)期、發(fā)酵工藝等因素最終影響了活性物質(zhì)的含量。目前，企業(yè)為提高諾麗果汁、果粉等營(yíng)養(yǎng)成分含量與結(jié)構(gòu)，產(chǎn)品發(fā)酵原材常使用質(zhì)地柔軟、不易儲(chǔ)存的熟果期果實(shí)，而熟果期的果實(shí)易在自身酶與內(nèi)生菌的作用下數(shù)小時(shí)之內(nèi)迅速軟化，甚至因部分液化而滲出果汁，極其不利于運(yùn)輸與儲(chǔ)藏[29]。為應(yīng)對(duì)這一情況，企業(yè)往往根據(jù)諾麗種植地區(qū)，就近選擇場(chǎng)址進(jìn)行后續(xù)的生物發(fā)酵，或是在運(yùn)輸途中進(jìn)行物理低溫儲(chǔ)藏及使用抑制后熟作用的化學(xué)試劑。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，硬白果期和熟果期的果實(shí)中主要活性物質(zhì)的含量差異較小，綜合考慮諾麗果產(chǎn)量與品質(zhì)等因素，硬白果期為最適宜的采收時(shí)期。

近年來(lái)，已經(jīng)有不少證據(jù)證明諾麗對(duì)人體有相當(dāng)多的保健功效。在一例研究化療副作用的報(bào)告中，連續(xù)服用60 d，每日早晚各1 次，每次50 mL的西沙諾麗果汁的鼻咽癌中期患者在化療期間，機(jī)體白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的驟減、食欲減退及惡心嘔吐等副作用隨服用時(shí)間延長(zhǎng)而明顯改善[30]。Pachauri等[31]構(gòu)建的小鼠模型顯示，印度諾麗干果可通過(guò)抑制乙酰膽堿酯酶的活性增強(qiáng)記憶力，并且含有蘆丁、槲皮素、東莨菪亭等提取物同樣具有改善記憶力的功效。Akihisa 等[32]基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，富含環(huán)烯醚萜等13種化合物的果汁可對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用，在100 mmol/L的濃度下，可使黑色素減少34%～49%，并且無(wú)細(xì)胞毒性。值得注意的是，針對(duì)諾麗健康產(chǎn)品與其植物原材料中單體活性成分和含量的檢測(cè)及研究在國(guó)內(nèi)外尚鮮有報(bào)道。本研究以我國(guó)本土的西沙野生諾麗為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)其3個(gè)關(guān)鍵熟期果實(shí)中主要單體活性成分及其含量變化的分析，揭示了這些成分在諾麗果中的化學(xué)分布及其隨果實(shí)成熟過(guò)程而發(fā)生的含量變化規(guī)律，研究結(jié)果可以為不同功能導(dǎo)向的諾麗健康產(chǎn)品生產(chǎn)加工過(guò)程中合理選擇不同熟度的諾麗果原材料提供科學(xué)依據(jù)。

4?結(jié)論

本研究表明，車葉草苷酸、去乙酰車葉草苷酸、東莨菪亭和槲皮素的含量均隨西沙諾麗果實(shí)的成熟而不斷增加，青果期到硬白果期諾麗果中上述活性物質(zhì)的含量變化較大，而硬白果期和熟果期的果實(shí)中上述活性物質(zhì)的含量差異較小，不同功能導(dǎo)向的諾麗健康產(chǎn)品生產(chǎn)加工過(guò)程中應(yīng)合理選擇不同熟度的諾麗果。

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