張恒 管玲玲 田浩 門秀麗

【摘要】目的：建立高糖培養(yǎng)基誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積模型，探討益母草苷（Ajugol）對脂質(zhì)代謝的影響及其可能機(jī)制。方法：將HepG2細(xì)胞分為對照組（BSA組）， BSA + Ajugol，Palmitate，Palmitate + Ajugol四組。通過油紅O染色觀察各組HepG2細(xì)胞體內(nèi)的脂肪含量，Ad-mCherry-GFP-LC3B檢測各組HepG2細(xì)胞體內(nèi)的自噬變化，Western blotting法檢測各組HepG2細(xì)胞體內(nèi)自噬的相關(guān)蛋白表達(dá)含量。結(jié)果：Ajugol實(shí)驗(yàn)組中的LC3蛋白含量增多，并且ajugol實(shí)驗(yàn)組中的脂質(zhì)有明顯減少。結(jié)論：Ajugol能促進(jìn)自噬減少HepG2細(xì)胞體內(nèi)的脂質(zhì)蓄積。

【關(guān)鍵詞】益母草苷;脂質(zhì)代謝;自噬;

【中圖分類號】R29 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助課題（81370918）

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)的特有功能，它通過自噬體與溶酶體融合行成自噬溶酶體將細(xì)胞內(nèi)破損的細(xì)胞器，錯誤折疊的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)進(jìn)行降解[1]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)中藥中的有效成分有減少脂質(zhì)蓄積的作用，據(jù)報(bào)道熟地黃有緩解非酒精性脂肪肝的作用，但是目前不知道熟地黃中的成分ajugol是否具有緩解非酒精性脂肪肝的作用[2]。因此，通過建立HepG2細(xì)胞高脂模型，觀察ajugol是否對脂肪肝產(chǎn)生預(yù)防作用，為臨床防治脂肪肝提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑

人類肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞購自American Type Culture Collection公司。BCA蛋白測定試劑盒（中國北京碧云天生物公司），P62抗體（美國Sigma公司），油紅O染色液（中國北京索萊寶科技有限公司）。

1.2主要試劑配制

棕櫚酸酯（Palmitate）配制如下所述，棕櫚酸酯/牛血清白蛋白（BSA）耦合物是將20 mM的palmitate在0.01 M的NaOH孵育30 min以后，然后將5%無脂肪酸的BSA與palmitate以3：1的體積混合，所得到的共軛物含有5 mM的palmitate和3.75%的BSA。使用之前需用DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。

1.3 免疫熒光

在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次。用4%的多聚甲醛固定15min接著用1%Triton X-100室溫通透20min接著用PBS浸洗玻片3次，然后用BSA（1%）封閉30min。每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗，4℃孵育過夜，緊接著加熒光二抗，孵育室溫2h，隨后滴加DAPI避光孵育5min。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4 Real-time

將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約為5×105個。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后換成相應(yīng)的條件培養(yǎng)基收集細(xì)胞，按照試劑盒提取細(xì)胞總RNA，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)Real-time PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以2-ΔCt方法計(jì)算PPARα，p62和ATG7 mRNA表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組HepG2細(xì)胞中LC3蛋白表達(dá)水平以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組HepG2細(xì)胞中油紅O水平

油紅O染色結(jié)果顯示， ajugol治療組能較明顯的減少脂質(zhì)在HepG2細(xì)胞上的聚集（P&lt;0.05或P<0.01）。

2.2 各組HepG2細(xì)胞在激光共聚焦下的LC3表達(dá)水平

與BSA實(shí)驗(yàn)組相比，ajugol實(shí)驗(yàn)組能明顯增強(qiáng)自噬體的數(shù)量，此外，palmitate + Ajugol實(shí)驗(yàn)組中的自噬體較Palmitate實(shí)驗(yàn)組的自噬體有所增加，結(jié)果表明ajugol能促進(jìn)自噬（P<0.05或P<0.01）。

2.3 各組HepG2細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平

與BSA實(shí)驗(yàn)組比較，ajugol組HepG2細(xì)胞中PPARα，p62和ATG7 mRNA表達(dá)水平增高（P<0.05）;與BSA + ajugol實(shí)驗(yàn)組相比， palmitate + ajugol實(shí)驗(yàn)組中的PPARα，p62和ATG7 mRNA表達(dá)水平升高（P<0.01）。

3 討論

本研究致力于在細(xì)胞水平上探討中藥中的有效成分益母草苷對NAFLD的治療作用及其機(jī)制。通過HepG2細(xì)胞造模， 模擬出NAFLD的細(xì)胞模型， 從油紅O染色的結(jié)果可以看出， 益母草苷可顯著降低細(xì)胞模型中脂滴含量。同時， 通過LC3B的免疫熒光染色檢測發(fā)現(xiàn)，改善脂質(zhì)沉積的機(jī)制與自噬有一定的相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)對自噬的相關(guān)基因P62和ATG7進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)益母草苷能較明顯的增強(qiáng)自噬基因的表達(dá)，并且益母草苷促進(jìn)PPARα基因的表達(dá)，提示益母草苷能減少脂質(zhì)在HepG2細(xì)胞體內(nèi)的蓄積。因此，推測益母草苷通過誘導(dǎo)自噬減少脂質(zhì)在機(jī)體內(nèi)的蓄積。

綜上所述，益母草苷在增強(qiáng)細(xì)胞的自噬水平的同時，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，說明益母草苷可能通過增強(qiáng)非酒精性脂肪肝細(xì)胞的自噬水平降低非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型脂質(zhì)沉積生， 因此可能對非酒精性脂肪肝具有一定的治療效果。

參考文獻(xiàn)：

[1]Yoomi， Chun， Joungmok et al. Autophagy： An Essential Degradation Program for Cellular Homeostasis and Life [J]. Cells， 2018.

[2]Zhang R X， Li M X， Jia Z P. Rehmannia glutinosa： review of botany， chemistry and pharmacology [J]. Journal of Ethnopharmacology， 2008， 117（2）：199-214.