張延濤 孫 勇 張遠鵬

(山東省濟南市人民醫(yī)院兩腺外科，濟南市 271100，電子郵箱：zhangyantao71@163.com)

近年來，乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重危害婦女的身心健康，是全球婦女癌癥死亡的主要原因[1]。目前，乳腺癌的主要治療方法包括手術(shù)、化療、放療、激素治療和靶向抗體治療。乳腺癌整體治療效果較好，但傳統(tǒng)治療方法仍存在缺乏特異性、化療抵抗、易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等問題，這些都是乳腺癌治療失敗的原因[2]。尋找能選擇性干預(yù)癌細胞信號傳導(dǎo)、調(diào)控細胞增殖和分化的低分子腫瘤抑制物，是抗癌藥物研究的重要方向，其中海洋生物活性物質(zhì)抗腫瘤作用是重要的研究內(nèi)容之一[3-4]?？谖r蛄又名瀨尿蝦，是一種常見的海洋生物食材。近年研究發(fā)現(xiàn)，口蝦蛄含有的生物堿和蛋白多肽類物質(zhì)對肝癌、胃癌、鼻咽癌等腫瘤細胞的增殖有明顯抑制作用[5]。但口蝦蛄提取物(extract of Squilla oratoria,ESO)是否對耐藥乳腺癌MCF-7細胞的增殖有抑制作用以及是否有廣譜抗癌的特性，尚未見研究報道。本研究探討ESO誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細胞凋亡及其機制，旨在為ESO用于乳腺癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 ESO的制備 于海鮮市場采購新鮮的口蝦蛄50 kg，體長11～13 cm，體重30～40 g，產(chǎn)地為廣東省湛江市?？谖r蛄的促熟培育與抱卵孵化水質(zhì)標準：溶氧5 mg/L，日換水1/4～1/3，透明度30～50 cm，水溫控制在20℃～30℃，鹽度各海區(qū)基本適合。烘干粉碎后稱重，采用濕法提取口蝦蛄抗腫瘤有效活性成分：用95%食用乙醇浸泡3次，48 h/次，浸泡液于室溫下以3 000 r/min離心15 min后留取上清液；混勻后在56℃恒溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)12 h，得到乙醇粗提取物。乙醇粗提取物與水按1 ∶3體積比混合，60℃下攪拌，待有乳濁液分層出現(xiàn)，加入一半體積的乙酸乙酯充分震蕩，待明顯分層后，取上層黃色澄清溶液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮得到黃褐色膏狀物，即為口蝦蛄乙酸乙酯提取物。臨用前用含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基將口蝦蛄乙酸乙酯提取物母液稀釋成所需終濃度5、10、20、40 μmol/L。

1.2 試劑與儀器 人乳腺癌MCF-7細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所(批號20180117)；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基購自美國HyClone公司(批號：AH0348)；胎牛血清購自美國Gibco公司(批號：MH0742)；細胞計數(shù)試劑盒8(cell counting kit-8,CCK-8)購自日本Dojindo公司(批號：20180109)；7500型實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司；FACSCalibur型流式細胞儀購自美國BD公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)購自廣州威佳科技有限公司(批號：20190203)；膜聯(lián)蛋白V/碘化吡啶試劑盒購自美國BD公司(批號：559763)；PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒購自美國BD公司(批號：20191015)。焦炭酸二乙酯(diethylpyrocarbonate，DEPC)水、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq聚合酶、瓊脂糖凝膠購自大連寶生物工程有限公司(批號：1612-42-6、50145121、161245、51211、B1223018)。青霉素鏈霉素雙抗購自上海復(fù)申生物科技有限公司(批號:SV30010.01)。

1.3 細胞培養(yǎng) 在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素鏈霉素雙抗的杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基中接種MCF-7乳腺癌細胞，然后在37℃、5% CO2、飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)，待細胞進入指數(shù)生長期后進行傳代培養(yǎng)。

1.4 細胞活力檢測 分為空白對照、陰性對照及4個濃度ESO組進行實驗。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入10 μL，約含3 000個細胞，在37℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。空白對照組加入100 μL不含腫瘤細胞的完全培養(yǎng)基，陰性對照組加入等體積含腫瘤細胞的培養(yǎng)基，4個濃度ESO組分別加入5、10、20、40 μmol/L ESO，每個濃度設(shè)有3個平行復(fù)孔。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h，然后在酶標儀450 nm處讀取吸光度(A)值，并計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=[(A陰性對照組-A實驗組)/(A陰性對照組-A空白對照組)]×100%。

1.5 細胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期MCF-7細胞，調(diào)整濃度為1×106個/mL。用不同濃度(0、5、10、20、40 μmol/L)的ESO處理48 h，然后收集細胞懸液，以300 r/min離心10 min并棄上清，再用冷PBS洗滌2次。在2 mL結(jié)合緩沖液中輕輕再懸浮，將0 μmol/L ESO處理的MCF-7細胞以每管500 μL的量分裝至空白對照組，同時將5、10、20、40 μmol/L ESO處理的MCF-7細胞以相同的量分別分裝至5、10、20、40 μmol/L ESO組，即實驗組。各組均加入5 μL膜聯(lián)蛋白V和5 μL碘化吡啶，室溫避光孵育20 min后，采用350目尼龍膜過濾，再用FACSCalibur流式細胞儀檢測，實驗重復(fù)3次取平均值。通過內(nèi)部系統(tǒng)軟件計算凋亡細胞的百分比。

1.6 細胞周期檢測 取對數(shù)生長期MCF-7細胞，調(diào)整濃度為1×106個/mL，使用不同濃度(0、5、10、20、40 μmol/L)的ESO干預(yù)MCF-7細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后用胰蛋白酶法采集細胞，PBS洗滌2次，采用-20℃預(yù)冷的70%乙醇固定，置于4℃冰箱中下保存過夜。固定好的細胞樣本通過1 500 r/min離心去除乙醇，采用PBS洗滌2次，再懸浮在冷PBS中，然后加入20 μg RNase A(10 μg/mL)和2 μL碘化吡啶(2.5 μg/mL)染色液，4℃避光孵育30 min，采用350目尼龍膜過濾。用流式細胞儀測定各組細胞的DNA含量，并利用內(nèi)置軟件計算細胞周期百分率。

1.7 細胞凋亡相關(guān)基因表達量的檢測 取對數(shù)生長期MCF-7細胞，調(diào)整濃度為1×106個/mL，用不同濃度(0、5、10、20、40 μmol/L)的ESO處理48 h，然后收集細胞懸液，用預(yù)冷的PBS洗2次后， 每孔加入100 μL預(yù)冷的RIPA細胞裂解液，將細胞刮下來后轉(zhuǎn)移到EP管中，置于冰上裂解，4℃振搖30 min后，13 000 r/min離心10 min，收集上清。采用TRIzol法提取總RNA，并用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定RNA。將RNA(4 μL)加入反應(yīng)混合物[4 μL 5×RT緩沖液、0.5 μL Oligo(dT)、0.5 μL dNTPs、1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、10 μL DEPC水]，按PrimeScriptTMRT Reagent Kit試劑盒說明書進行操作，37℃反應(yīng)30 min，85℃反應(yīng)5 s，95℃下終止反應(yīng)5 min，使M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶失活，合成第一鏈cDNA。以cDNA作為模板，利用合成好的特異性引物(上海杰盾生物技術(shù)有限公司設(shè)計)進行中間片段的擴增。每管為10 μL反應(yīng)體系(Taq酶5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、cDNA 1 μL、DEPC水3 μL)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火及延伸30 s，前3個步驟經(jīng)40個循環(huán)，65℃～95℃，每升高0.5℃保持5 s，采集熒光。p53、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、p70s6k及內(nèi)參基因引物序列見表1，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，采用7500型實時熒光定量PCR儀進行mRNA表達量的檢測。每次試驗均設(shè)(無模板)對照，排除污染，每個樣本重復(fù)3次。用Bio-Rad CFX Manager軟件通過經(jīng)內(nèi)參GADPH校正后的Ct值和擴增效率自動計算各目的基因mRNA相對表達量。

表1 實時聚合酶鏈的引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以(x±s)表示，方差齊時，比較采用單因素方差分析，兩兩比較比較采用SNK-q法；方差不齊時，對數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后采用校正后的方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ESO對MCF-7細胞活性的影響 培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)分別為65.112 μmol/L、33.156 μmol/L、18.785 μmol/L。培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，不同濃度ESO組乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制率均高于陰性對照組，且培養(yǎng)24 h、48 h時，乳腺癌MCF-7細胞抑制率隨ESO濃度升高而依次升高；培養(yǎng)72 h時，乳腺癌MCF-7細胞抑制率隨干預(yù)濃度升高而依次升高；5、10、20 μmol/L ESO組乳腺癌MCF-7細胞抑制率均隨培養(yǎng)時間延長而依次升高，40 μmol/L培養(yǎng)48 h、72 h的細胞抑制率均高于培養(yǎng)24 h時(均P<0.05)。見表2。

表2 5組乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后的增殖抑制率(x±s，%)

2.2 ESO對MCF-7細胞凋亡的影響 給予5、10、20、40 μmol/L ESO干預(yù)MCF-7細胞48 h后，各ESO濃度組的細胞凋亡率均高于空白對照組，且細胞凋亡率隨ESO給藥濃度增加而升高(均P<0.05)。見表3和圖1。

圖1 不同濃度ESO誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡情況

表3 干預(yù)48 h后各組細胞的凋亡率比較(x±s，%)

2.3 ESO對MCF-7細胞周期的影響 ESO作用于人MCF-7細胞48 h后，出現(xiàn)G1期細胞阻滯現(xiàn)象，S期和G2期細胞均相應(yīng)減少。10、20、40 μmol/L ESO組G0/G1期細胞百分率均高于0、5 μmol/L ESO組，且依次升高；20、40 μmol/L ESO組S期細胞百分率均低于其他ESO組，且40 μmol/L ESO組低于20 μmol/L ESO組；其他濃度ESO組G2/M期細胞百分率均低于0 μmol/L ESO組(均P<0.05)。見表4和圖2。

圖2 不同濃度ESO對MCF-7細胞周期的影響

表4 各細胞周期中各組的細胞百分率比較(x±s，%)

2.4 ESO對細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響 MCF-7細胞的Bax mRNA 表達量隨著ESO干預(yù)濃度增加而升高(均P<0.05)； 10、20、40 μmol/L ESO組p53 mRNA表達量均高于0、5 μmol/L ESO組，且依次升高(均P<0.05)；20、40 μmol/L ESO組 Bcl-2 mRNA表達量均低于0、5 μmol/L ESO組，且40 μmol/L ESO組低于10 μmol/L ESO組(均P<0.05)；其他濃度ESO組mTOR和p70s6k mRNA 表達量均低于0 μmol/L ESO組, 40 μmol/L ESO組mTOR mRNA 表達量低于5 μmol/L ESO組，且p70s6k mRNA 表達量低于5、10 μmol/L ESO組(均P<0.05)。見表5。

表5 5組細胞凋亡相關(guān)基因相對表達量比較(x±s)

3 討 論

乳腺癌是一種常見且嚴重的女性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈不斷上升趨勢。目前乳腺癌的臨床治療仍存在副作用嚴重和耐藥性問題，亟需新的抗腫瘤藥物改善病情[6]。許多天然化合物具有抗腫瘤作用，近年來從海洋生物中尋找抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物開發(fā)的策略之一。因此，本研究探討ESO對人乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響具有重要意義。結(jié)果顯示，ESO對MCF-7細胞具有抗增殖活性，并呈劑量依賴性和時間依賴性，且ESO干預(yù)后MCF-7細胞出現(xiàn)G1期細胞阻滯現(xiàn)象，這提示ESO可使乳腺癌MCF-7細胞周期發(fā)生阻滯從而抑制細胞增殖。

此外，我們發(fā)現(xiàn)ESO可誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡，且凋亡率呈劑量依賴性增加。程序性細胞死亡被證明是哺乳動物細胞在生理條件下死亡的主要形式，是一個快速且不可逆的過程[7]。Bcl-2家族的失調(diào)可能與逃避癌細胞凋亡有關(guān)[8]。Bax、Bcl-2是凋亡基因Bcl-2家族的兩個重要成員，分別作為抗凋亡信號、促凋亡信號，通過形成同源二聚體來調(diào)節(jié)細胞凋亡[9]。促凋亡相關(guān)蛋白在人類眾多癌癥中往往呈低表達，而低表達的促凋亡蛋白因子會降低腫瘤耐藥細胞對化療的敏感性[10]。因此，尋找能夠增加Bax表達或恢復(fù)腫瘤細胞凋亡能力的新的細胞毒性藥物具有重要意義[11]。p53是與癌癥相關(guān)的最常見突變基因，在多種應(yīng)激誘發(fā)的凋亡中起關(guān)鍵作用[12]，其通過在G1期或間期停止細胞周期來阻止細胞復(fù)制，從而增強癌細胞凋亡[13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)ESO干預(yù)后MCF-7細胞的p53和Bax mRNA表達量升高且呈劑量依賴性，而Bcl-2的表達量降低。有研究表明，野生型p53能夠上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2，進而導(dǎo)致程序性細胞死亡[14]。因此，推測ESO或通過上調(diào)p53的表達從而調(diào)控Bax和Bcl-2，進而在促進乳腺癌細胞凋亡的過程中發(fā)揮作用。然而，目前對Bcl-2和Bax的表達激活機制尚不完全清楚。

mTOR能驅(qū)動細胞增殖，在多種癌細胞系和乳腺癌中表達上調(diào)[15]。mTOR由多蛋白復(fù)合物mTORc1和mTORc2組成。mTORc1可磷酸化下游蛋白p70s6k，通過調(diào)節(jié)蛋白合成、核糖體生物發(fā)生和自噬來調(diào)節(jié)細胞生長[16-17]。本研究中，經(jīng)ESO作用后，MCF-7細胞的mTOR和p70S6K的mRNA表達量均下降，提示ESO可能通過抑制mTOR通路，進而抑制MCF-7細胞增殖。已有研究證顯示，p53可以通過激活A(yù)MP反應(yīng)蛋白激酶抑制mTOR[18]，因此，p53調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物或可負調(diào)控mTOR通路，從而參與乳腺癌細胞的凋亡。目前，在許多研究中p53和mTOR通路都是單獨靶向的，而不是共同靶向的，關(guān)于mTOR通路和p53通路之間相互作用的詳細機制尚不清楚。因此，在今后的研究中，如何利用mTOR與p53之間的通路來制定治療癌癥的有效策略，仍有待解決。

綜上所述，ESO可促乳腺癌MCF-7細胞周期發(fā)生阻滯從而抑制乳腺癌細胞增殖；此外，ESO可能通過上調(diào)p53的表達以調(diào)控Bax、Bcl-2、mTOR、p70s6k的表達，從而誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡。