熊 丹， 周 霆， 田方艷， 饒力群， 陳 松， 汪啟明

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128； 2.湖南遠泰生物技術(shù)有限公司，湖南 長沙 410000； 3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所/農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室,江蘇 南京 210014)

油脂是人體必需的關(guān)鍵營養(yǎng)素之一，是維持身體機能正常運轉(zhuǎn)的能量來源，更是細胞、組織、臟器的重要組成成分。油菜是僅次于大豆和花生的第三大植物油脂來源[1]，菜籽油含有豐富的油酸、亞油酸、亞麻酸以及維生素E等有效成分，亞油酸、亞麻酸是人自身無法合成的必需脂肪酸，百分之九十九能被人體所吸收[2-3]。適量的補充亞油酸和亞麻酸等不飽和脂肪酸，可軟化血管，預(yù)防心血管疾病的發(fā)生[4]，但是亞油酸和亞麻酸相較于油酸，更容易氧化發(fā)生酸敗，產(chǎn)生不利于健康的物質(zhì)[5-6]。如何合理控制各脂肪酸比例構(gòu)成，提高菜籽油品質(zhì)，已成為油菜品種改良的重要研究方向。

前期對甘藍型油菜高油酸品種的基因分析結(jié)果表明，其高油酸性狀的產(chǎn)生是由于FAD2基因突變導(dǎo)致[7-10]。FAD2基因編碼的是一種脂肪酸脫氫酶2(FAD2)，該蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，催化油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸[11-13]。亞油酸又可被脂肪酸脫氫酶3轉(zhuǎn)化為亞麻酸[14]。所以，F(xiàn)AD2是控制油菜高油酸產(chǎn)量，保持脂肪酸穩(wěn)定性的關(guān)鍵基因，多個油菜品質(zhì)改良項目曾圍繞此基因進行[15-17]。

目前，對于FAD2基因功能改變的檢測，主要還是以FAD2酶催化的底物和產(chǎn)物含量的變化為主。即通過氣相[18]、液相[19]以及紅外光譜[20-21]等手段，檢測樣本中油酸和亞油酸或亞麻酸含量的變化，從而監(jiān)測此基因功能是否改變。在利用免疫學(xué)方法對蛋白質(zhì)積累檢測方面，由于暫未有商業(yè)化的可用于植物FAD2蛋白檢測的特異性抗體及其相關(guān)制備報道，在前期研究中，主要是用基因工程方法融合其他標簽，通過使用標簽抗體對融合標簽進行檢測[13,22]來體現(xiàn)FAD2蛋白表達變化，并不能完全體現(xiàn)內(nèi)源性FAD2蛋白表達的變化。本研究對甘藍型油菜FAD2蛋白進行生物信息學(xué)分析，通過合成特征性多肽片段免疫動物，獲得特異性針對甘藍型油菜FAD2蛋白的兔源多克隆抗體，為該蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控機制的研究提供有利工具?？梢杂么丝贵w識別不同品種油菜不同栽培條件下FAD2蛋白表達差異，為后期育種篩選及栽培條件優(yōu)化以及轉(zhuǎn)基因安全評價方法的簡化提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要植物材料

甘藍型油菜品種(Westar)WT和FAD2-RNAi高油酸轉(zhuǎn)基因油菜品系W-4由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所提供。

1.2 試驗動物

本研究選用的動物為2只雄性新西蘭大白兔，購于湖南太平生物科技有限公司。在湖南遠泰生物技術(shù)有限公司清潔級動物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，室溫維持22 ℃，正常的晝夜頻率，一兔一籠。提供充足的飼料和干凈的飲用水，試驗動物可以自由進食和飲水，維持體質(zhì)量在2.5～3.5 kg。該動物試驗方案得到了湖南遠泰生物技術(shù)公司動物倫理委員會的批準(依據(jù)《Guide for the Care and Use of Laboratory Animals》)。

1.3 主要試劑

HRP labeled anti-IgG、anti-Mouse IGG-HRP monoclonal antibody由Promab提供，anti-actin Mouse monoclonal antibody購于CWbio公司，anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody、ECL試劑盒購于CST公司，弗氏完全佐劑以及弗氏不完全佐劑購于Sigma公司，Protein A Sepharose購于GE公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于北京鼎國公司，蛋白質(zhì)marker購于Thermo Fisher公司，BCA蛋白檢測試劑盒購于BioSharp公司。

研磨緩沖液(0.240 mol/L Hepes·NaOH pH 7.5, 0.060 mol/L KCl, 0.250 mol/L蔗糖, 0.024 mol/L MgCl2)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離緩沖液(0.040 mol/L Hepes·NaOH pH 7.5, 0.010 mol/L KCl, 0.040 mol/L MgCl2, 0.005 mol/L EDTA)，儲存于4 ℃條件下，使用前加入0.006 mol/L DTT, 0.006 mol/L PMSF。

1.4 抗原確定與合成

在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中搜索關(guān)鍵詞：BnFAD2，得到油菜FAD2蛋白氨基酸序列信息。

采用ABCpred Prediction Server在線軟件[23]分析BnFAD2(UniProtKB：C3W518)氨基酸B細胞抗原表位，將預(yù)測表位陣列得分超過0.9的序列，輸入NCBI數(shù)據(jù)庫中，與油菜蛋白質(zhì)庫進行氨基酸序列比對，驗證氨基酸表位序列的特異性。選取得分以及特異性最高的2條多肽序列(PA和PB)，于杭州中肽生化有限公司進行多肽合成，并將合成好的多肽分別偶聯(lián)到KLH和BSA上。

1.5 BnFAD2兔源多克隆抗體的制備

1.5.1 動物免疫 初次免疫前，兔耳靜脈采血作為免疫陰性對照血清。BnFAD2-PA-KLH多肽與BnFAD2-PB-KLH多肽凍干粉溶解后，各取50 mg混合均勻，再與等體積弗氏完全佐劑按比例混合，多點皮下注射新西蘭大白兔。21 d后，混合抗原量減半與弗氏不完全佐劑混合，進行第二次免疫。以此方式每隔14 d，進行第三以及第四次免疫。4次免疫后7 d，兔耳靜脈采血，常溫下3 000 r/min離心20 min，取血清，用于后續(xù)檢測。

1.5.2 免疫酶聯(lián)法檢測免疫血清 酶標板中抗原BnFAD2-PA-BSA以及BnFAD2-PB-BSA的包被量為每孔0.2 μg。以免疫前血清為陰性對照，以1∶5 000稀釋HRP labeled anti-IgG作為二抗，檢測不同稀釋度的免疫兔血清，TMB顯色終止后，在酶標儀上讀取吸光度值(OD450)。

1.5.3 BnFAD2兔源多克隆抗體的純化 收集全兔血，離心分離血清。按照說明書所述方法，將血清進行Protein A Sepharose親和層析純化，獲得BnFAD2兔源多克隆抗體。用SDS-PAGE凝膠法鑒定該兔多抗的蛋白質(zhì)分子量大小與純度，BCA法鑒定其濃度。

1.6 甘藍型油菜品種W-4不同世代FAD2蛋白表達的鑒定

1.6.1 油菜樣本總蛋白質(zhì)的提取 取一定體積的樣品(WT、W-4的T3代,W-4的T7代植株開花21 d后的果莢以及成熟期葉片)，液氮研磨成粉末狀后，參照文獻[24]、[25]，研磨緩沖液勻漿,經(jīng)2次2 000g離心5 min后，取2 ml上清液樣品留樣，其余上清液加入到含有5 ml 50%蔗糖溶液的超離心管中，100 000g離心20 min，收集總膜層(50%蔗糖溶液與勻漿上清液之間)，等體積混合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離緩沖液，采用蔗糖梯度(7 ml 15% 蔗糖溶液，12 ml 35% 蔗糖溶液和5 ml 40% 蔗糖溶液)100 000g離心30 min，收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜組分(35% 蔗糖與40% 蔗糖溶液之間)，加入3倍體積內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離緩沖液，100 000g離心30 min，沉淀用少量預(yù)冷的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離緩沖液重懸，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。所有離心均在4 ℃進行。

1.6.2 SDS-PAGE分離蛋白質(zhì) 根據(jù)SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)說明書配制分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%的SDS-PAGE凝膠。將樣本分果莢總蛋白質(zhì)、葉片總蛋白質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)3個組別，每個組別經(jīng)BCA法進行蛋白質(zhì)定量后，統(tǒng)一上樣量，用Mini-PROTEAN? Tetra(Bio-Rad)系統(tǒng)進行凝膠電泳。

1.6.3 Western Blotting法鑒定甘藍型油菜同世代 FAD2蛋白表達 樣品通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)至NC膜上。經(jīng)5%的脫脂奶封閉1 h，一抗(anti-BnFAD2 Rabbit Polyclonal antibody，稀釋比為1∶1 000，anti-actin Mouse monoclonal antibody，稀釋比為1∶2 500)孵育過夜，用PBST緩沖溶液進行洗膜后加入對應(yīng)的二抗(anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody,稀釋比為1∶30 000，anti-Mouse IGG-HRP monoclonal antibody，稀釋比為1∶10 000)，室溫孵育2 h，洗膜后，使用ECL試劑盒進行顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜FAD2抗原表位預(yù)測和鑒定

在UniProtKB數(shù)據(jù)庫中搜索關(guān)鍵詞：BnFAD2，得到油菜FAD2蛋白氨基酸序列信息，其UniProtKB序列號為C3W518，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(圖1A)，是由384個氨基酸組成的4次跨膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(如圖1B所示)。ABCpred在線系統(tǒng)對該氨基酸序列進行B細胞表面抗原表位預(yù)測，肽的較高得分意味著有較高的概率作為表位。方框中氨基酸部分為此抗原表位預(yù)測分數(shù)超過0.9的區(qū)域(圖1 C)。參考預(yù)測結(jié)果和蛋白質(zhì)細胞亞定位的特點，我們選擇位于細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)中并且預(yù)測分數(shù)較高的區(qū)域，在NCBI數(shù)據(jù)庫中對油菜蛋白質(zhì)氨基酸序列進行比對，最后選擇PA:VSPPSKKSETDTIKR(9～23 aa)以及PB:SHRRHHSNTGSLERD(140～154 aa)2條多肽為免疫抗原表位(命名及區(qū)域氨基酸序列如圖1 B下劃線部分所示)。

A:BnFAD2蛋白的亞細胞定位(圖片來源于UniProtKB數(shù)據(jù)庫);B:BnFAD2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)簡圖與抗原肽段選擇位點;C:ABCpred在線系統(tǒng)對BnFAD2 B細胞表面抗原表位的預(yù)測結(jié)果。劃橫線的表示合成多肽的氨基酸序列；方框里表示抗原表位預(yù)測分數(shù)超過0.9的區(qū)域。圖1 BnFAD2抗原表位預(yù)測Fig.1 Epitopes prediction of BnFAD2

用質(zhì)譜法(Mass spectrum, MS)進行多肽鑒定。結(jié)果如圖2顯示，BnFAD2-PA的相對分子質(zhì)量為1 776，BnFAD2-PB的相對分子質(zhì)量為1 892，2條多肽測定的相對分子質(zhì)量與理論值相符。

圖2 BnFAD2多肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of BnFAD2 polypeptide by mass spectrometry

用高效液相法(High performance liquid chromatography, HPLC)對2條合成的多肽進行純度分析(圖3)，BnFAD2-PA的純度為80.19%，BnFAD2-PB的純度為96.24%(表1)。

圖3 BnFAD2多肽的高效液相分析結(jié)果Fig.3 Identification of BnFAD2 polypeptide by high performance liquid chromatography

表1 BnFAD2-PA以及BnFAD2-PB純度分析

2.2 BnFAD2兔源多克隆抗體的獲得

將第四次免疫后第7 d采集的兔血清進行ELISA試驗，鑒定免疫效果。如圖4所示，1號兔和2號兔免疫抗原后，對BnFAD2-PA與BnFAD2-PB多肽都產(chǎn)生了免疫反應(yīng)。1號兔免疫反應(yīng)高于2號兔。

取全血進行Protein A Sepharose親和層析，所得到的蛋白質(zhì)溶液10倍稀釋后進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，如圖5所示，在非變性條件下，該抗體在大于150 000處有條帶，與完整抗體分子條帶相符，變性條件下，在50 000以及25 000左右有兩條帶，即抗體重鏈和輕鏈。此蛋白質(zhì)大小與抗體大小相符，抗體結(jié)構(gòu)完整。BCA法定量得到稀釋后該抗體質(zhì)量濃度為0.57 mg/ml，獲得的抗體總產(chǎn)品質(zhì)量濃度為5.7 mg/ml。

A:包被抗原為BnFAD2-PA-BSA;B:包被抗原為BnFAD2-PB-BSA。圖4 BnFAD2多肽的免疫效果鑒定Fig.4 Immune effect identification of BnFAD2 polypeptide

M1: PageRuler預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準(Thermo); M2:Pierce非預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準(Thermo); 1:anti-BnFAD2純化后10倍稀釋樣本經(jīng)原性上樣緩沖液處理; 2：anti-BnFAD2純化后10倍稀釋樣本經(jīng)非還原性上樣緩沖液處理 。圖5 BnFAD2兔源多克隆抗體的SDS-PAGE鑒定Fig.5 Identification of anti-BnFAD2 rabbit-derived polyclonal antibody by SDS-PAGE

2.3 甘藍型油菜品種W-4不同世代FAD2蛋白表達鑒定

果莢總蛋白質(zhì)、葉片總蛋白質(zhì)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)通過BCA法測定每個樣本濃度后，樣本的上樣量總蛋白質(zhì)為每孔2 μg，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)為每孔1 μg，進行FAD2蛋白的Western blotting檢測。其結(jié)果如圖6所示，WT、W-4-T3代、W-4-T7代果莢以及WT、W-4-T3代、W-4-T7代成熟葉片的總蛋白質(zhì)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)均能在95 000左右檢測到條帶，WT條帶最高，而W-4-T7代最弱。葉片中，3個樣本差異不明顯。

3 討 論

A圖中抗原為果莢總蛋白。1，4，7為W-4-T7代；2，5，8為W-4-T3代；3，6，9為WT；B圖中抗原為葉片總蛋白。1，4，7為W-4-T7代；2，5，8為W-4-T3代；3，6，9為WT；A，B圖中，1，2，3：一抗為anti-BnFAD2；4，5，6：一抗為anti-actin；7，8，9：一抗為免疫前兔血清;依據(jù)一抗種屬選擇相應(yīng)二抗;C圖抗原，1，2，3：果莢內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，樣本依次為WT、W-4-T3代、W-4-T7代。4，5，6：葉片內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，樣本依次為WT，W-4-T3代，W-4-T7代。一抗為anti-BnFAD2，二抗為anti-Rabbit IGG-HRP Polyclonal antibody。圖6 甘藍型油菜品種W-4不同世代中FAD2蛋白表達鑒定Fig.6 Identification of FAD2 protein expression in different generations of Brassica napus cultivar W-4

抗體作為哺乳動物被動免疫應(yīng)答的產(chǎn)物，其對抗原的特異性識別功能已被研究者們成功應(yīng)用到基因表達水平變化的檢測中。目前，哺乳動物蛋白質(zhì)檢測抗體的種類齊全，免疫學(xué)檢測方法應(yīng)用較廣泛。植物在與生物脅迫以及非生物脅迫對抗的漫長進化過程中，造成了植物蛋白質(zhì)編碼基因的多樣性以及蛋白質(zhì)翻譯后的修飾非常復(fù)雜。因此與哺乳動物抗體相比，對其特異性抗體的開發(fā)和免疫學(xué)方法的應(yīng)用研究步伐較緩慢。特異性抗體的獲得，其免疫抗原的品質(zhì)很關(guān)鍵。目前多采用體外表達重組蛋白質(zhì)的方式來獲得高品質(zhì)抗原[26]。重組全長蛋白質(zhì)可以提供足夠的特征性抗原表位，用其免疫獲得的多克隆抗體，具有多種表位識別能力，可以更準確地捕獲天然裂解液中的微量抗原蛋白質(zhì)。而重組全長蛋白質(zhì)的獲得，受到多種因素的制約，如蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)特征、蛋白質(zhì)的大小及其等電點、疏水性等。FAD2是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜蛋白，預(yù)測相對分子質(zhì)量大小為44 171，具有4個跨膜區(qū)。利用原核表達系統(tǒng)得到其重組蛋白質(zhì)的難度較大。利用合成生物學(xué)，體外合成特征性多肽，再將其偶聯(lián)到具有強免疫原性的大分子上，可以解決免疫抗原的獲得問題[27-28]。而多個肽段的混合免疫，使免疫得到的多克隆抗體盡可能多地擁有多個表位的識別，提高抗體對微量抗原的識別能力。

本研究中利用生物信息學(xué)分析，獲得油菜BnFAD2蛋白高抗原性多肽序列，經(jīng)多肽合成后，混合免疫動物獲得抗體。BnFAD2-PA肽段位于跨膜導(dǎo)肽與第一跨膜區(qū)之間，是多種植物FAD2的共有序列，BnFAD2-PB肽段位于胞質(zhì)區(qū)域，是油菜FAD2的特異性序列。因此，混合免疫得到的兔源多克隆抗體，對于油菜FAD2有2個表面抗原識別位點，也可以利用其對植物FAD2共有序列的識別能力，應(yīng)用到其他植物FAD2的檢測鑒定中。

FAD2是將油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸的關(guān)鍵酶，而FAD3是將亞油酸轉(zhuǎn)化為亞麻酸的關(guān)鍵酶，這兩個酶同時位于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，在脂肪酸代謝途徑中屬于遞呈關(guān)系。有研究結(jié)果表明，擬南芥原生質(zhì)體中，當(dāng)FAD2和FAD3維持酶活性行使功能時，多以同源二聚體以及異源二聚體的形式存在[22]，其二聚體的比例與產(chǎn)物中亞油酸和亞麻酸的比例有直接關(guān)系。前期研究結(jié)果表明，F(xiàn)AD2在油菜開花后21 d含量達到最高，成熟期葉片維持一致[29]。W-4轉(zhuǎn)基因油菜與以往外源導(dǎo)入某種基因來增加或減弱相應(yīng)蛋白質(zhì)表達的方法不同，其是在導(dǎo)入含種子特異性啟動子的FAD2某段序列，利用RNAi的方法，有效抑制種子中FAD2的轉(zhuǎn)錄[30]。本研究中，采用野生型甘藍型油菜品種WT以及RNAi干擾轉(zhuǎn)基因型油菜品種W-4為試驗材料，提取其果莢和葉片中的總蛋白質(zhì)，分離收集其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)成分，BnFAD2兔源多克隆抗體均能在免疫印跡反應(yīng)中檢測到相應(yīng)物質(zhì)。果莢樣本中，Western blotting的結(jié)果顯示W(wǎng)-4的不同世代樣本FAD2蛋白表達較WT均呈現(xiàn)下降。在成熟葉片樣本中，W-4的不同世代樣本FAD2蛋白表達基本維持一致，提示該RNAi干擾載體中引入的種子特異性啟動子元件，組織特異性作用效果明顯。RNAi干擾轉(zhuǎn)基因型油菜品種W-4的FAD2組織特異性表達抑制效果，通過該BnFAD2兔源多克隆抗體得到蛋白質(zhì)水平上的內(nèi)源性驗證，為相關(guān)轉(zhuǎn)基因油菜品種提供了FAD2蛋白表達的檢測抗體。此外，免疫印跡檢測中，陽性條帶的位置與前期體外研究結(jié)果相符[22]，首次驗證內(nèi)源性油菜FAD2同樣以多聚體的形式在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上行使功能，而其多聚體的組合方式及其相應(yīng)生理功能的調(diào)控機制，還需要進一步試驗驗證。