王 斌, 朱世江

(1.韶關(guān)學(xué)院英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院/韶關(guān)市芳香植物工程技術(shù)研究中心,廣東 韶關(guān) 512005; 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院,廣東 廣州 510642)

低溫能有效降低采后果蔬的生理活動(dòng),如呼吸強(qiáng)度、乙烯產(chǎn)生速率等,低溫也能抑制病原微生物的生命活動(dòng),因此低溫貯運(yùn)是保持采后果蔬品質(zhì)、延長(zhǎng)果蔬貯藏壽命的最有效的方式之一[1]。黃瓜(CucumissativusL.)原產(chǎn)于亞熱帶地區(qū),由于黃瓜采收后呼吸強(qiáng)度較高,在常溫下貯藏保鮮期很短,因此通常采用低溫貯運(yùn)來(lái)延長(zhǎng)黃瓜的貯藏期和貨架期。此外，黃瓜是一種典型的冷敏型蔬菜,在10 ℃以下溫度貯藏時(shí)會(huì)產(chǎn)生冷害[2-3],受冷害的黃瓜抗病性下降,在貨架期易感病而發(fā)生嚴(yán)重的次生病害,從而降低了采后黃瓜的商品性,縮短其貨架期[4]。

通過(guò)適當(dāng)?shù)牟珊筇幚碚T導(dǎo)黃瓜的耐冷性,是延緩冷藏黃瓜冷害發(fā)生的重要方式。目前,誘導(dǎo)冷藏黃瓜耐冷性的采后處理方式主要有物理法、化學(xué)藥劑法和植物激素法等。其中物理法有熱法[3]、短波紫外照射法[5]和低溫預(yù)貯法[6]等;化學(xué)藥劑法有一氧化氮法[7]、褪黑素法[8]等;植物激素法有茉莉酸甲酯法[7]、腐胺法[9]和水楊酸法[10]等。以上處理方法均可在一定程度上誘導(dǎo)冷藏黃瓜的耐冷性,從而減輕黃瓜在冷藏期間的冷害癥狀。然而,上述處理方法或者需要使用藥劑,或者需要額外增加處理設(shè)備,這些均會(huì)顯著增加生產(chǎn)成本,而增加的生產(chǎn)成本最終會(huì)轉(zhuǎn)嫁到消費(fèi)者身上,不利于采后黃瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展,且化學(xué)誘抗劑處理可能還會(huì)產(chǎn)生食品安全問(wèn)題。因此,尋求一種既可以有效抑制冷藏黃瓜冷害,又不會(huì)顯著增加生產(chǎn)成本的處理方式,對(duì)于采后黃瓜產(chǎn)業(yè)來(lái)說(shuō)具有重要的實(shí)際意義。

果蔬采收后一般均需要及時(shí)預(yù)冷,以快速去除田間熱，降低果蔬的生理代謝，抑制果蔬表面微生物活動(dòng),從而延長(zhǎng)果蔬的貯藏期。因此,預(yù)冷在整個(gè)果蔬貯運(yùn)過(guò)程中起著極為重要的作用[11]。目前,關(guān)于預(yù)冷作用的研究主要集中在對(duì)果蔬感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)方面的影響[12-14],而鮮有關(guān)于預(yù)冷影響采后果蔬耐冷性方面的報(bào)道。此外,大多數(shù)研究更側(cè)重于預(yù)冷方式、預(yù)冷媒介以及預(yù)冷時(shí)間對(duì)果蔬產(chǎn)品品質(zhì)的影響[15],對(duì)冷庫(kù)階段降溫預(yù)冷的研究較少。本研究分析了階段降溫預(yù)冷處理對(duì)5 ℃冷藏黃瓜耐冷性的誘導(dǎo)作用,并從生理、基因表達(dá)層面探究其誘導(dǎo)冷藏黃瓜耐冷性的生理和分子機(jī)制,以期豐富人們對(duì)預(yù)冷作用的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用黃瓜購(gòu)自當(dāng)?shù)夭宿r(nóng),品種為津研四號(hào),黃瓜采收后及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

考馬斯亮蘭R250,產(chǎn)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;牛血清蛋白,產(chǎn)自美國(guó)Sigma公司;硫代巴比妥酸，產(chǎn)自上海展云化工有限公司;丙酮、硫酸鈦、25%濃氨水、濃硫酸,產(chǎn)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;三氯乙酸、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、α-萘胺、亞硝酸鈉、甲硫氨酸、過(guò)氧化氫和愈創(chuàng)木酚,產(chǎn)自天津市大茂化學(xué)試劑廠;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉,產(chǎn)自廣州化學(xué)試劑廠;還原性抗壞血酸、核黃素和四唑氮藍(lán)(NBT),產(chǎn)自南京奧多福尼生物有限公司;TRIzol試劑、iScript cDNA Synthesiskit試劑盒、SYBR Green RT-PCR kit熒光染料試劑盒,產(chǎn)自美國(guó)BIAO-RAD公司。以上所有試劑均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

UV-1800紫外分光光度計(jì),產(chǎn)自上海美普達(dá)儀器有限公司;PCDX-WJ-10全自動(dòng)超純水儀,產(chǎn)自成都品成科技有限公司;6380R高速冷凍離心機(jī),產(chǎn)自德國(guó)Eppendorf公司;DDS-307型電導(dǎo)率儀,產(chǎn)自上海精密科學(xué)儀器有限公司;IMAG-K7葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定儀,產(chǎn)自德國(guó)WALZ公司;PR-101α數(shù)顯折射儀,產(chǎn)自日本愛(ài)拓公司;Bio-Rad iCyeler iQTM/Clooo熒光定量PCR儀,產(chǎn)自美國(guó)Bio-Rad公司;-80 ℃超低溫冰箱,產(chǎn)自美國(guó)Thermo公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 處理及取樣 挑選果形端正、大小基本一致、無(wú)機(jī)械傷或病蟲(chóng)害的黃瓜為試驗(yàn)材料。將挑選后的黃瓜隨機(jī)分成2組,處理組先于10 ℃冷庫(kù)中預(yù)冷24 h,再于5 ℃冷庫(kù)中預(yù)冷48 h,對(duì)照組不經(jīng)任何低溫處理,最后將處理組、對(duì)照組同時(shí)置于5 ℃冷庫(kù)中貯藏。各處理均設(shè)3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)設(shè)60個(gè)黃瓜。貯藏期間每隔2 d觀察黃瓜的冷害狀況并取樣,果皮用于相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定,取樣后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 冷害指數(shù)(CII)和次生病害病情指數(shù)(SDI)的計(jì)算 參考Liu等[7]的方法測(cè)定冷害指數(shù),將黃瓜冷害指數(shù)分為5級(jí)：0級(jí),未發(fā)生冷害;1級(jí),冷害面積占總面積的比例低于25%;2級(jí),冷害面積占總面積的比例為26%～50%;3級(jí),冷害面積占總面積的比例為51%～75%;4級(jí),冷害面積占總面積的比例大于75%。計(jì)算公式：冷害指數(shù)=∑(級(jí)數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù)果實(shí)的數(shù)量)/總果實(shí)數(shù)量。

次生病害病情指數(shù)的測(cè)定參考Wang等[4]的方法,同樣將黃瓜次生病害病情指數(shù)分為5級(jí)：0級(jí),未發(fā)生病害;1級(jí),病害面積占總面積的比例低于25%;2級(jí),病害面積占總面積的比例為26%～50%;3級(jí),病害面積占總面積的比例為51%～75%;4級(jí),病害面積占總面積的比例高于75%。計(jì)算公式：次生病害病情指數(shù)=∑(級(jí)數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù)果實(shí)的數(shù)量)/總果實(shí)數(shù)量。

1.3.3 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定 相對(duì)電導(dǎo)率(REC)的測(cè)定參考Xia等[16]的方法。用削皮刀削取1 mm厚度的黃瓜果皮,每個(gè)重復(fù)用孔徑為0.5 cm的打孔器均勻打制20個(gè)黃瓜果皮小圓片。將小圓片用雙蒸水沖洗3遍后轉(zhuǎn)移至50 ml離心管中,并加入25 ml雙蒸水,在室溫(25 ℃)下浸泡2 h。測(cè)定初始電導(dǎo)率(C1),之后沸水浴30 min,自然冷卻至室溫(25 ℃)后測(cè)定終止電導(dǎo)率(C2)。計(jì)算公式：REC=C1/C2×100%。

1.3.4 PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)的測(cè)定 按照Wang等[17]的方法測(cè)定黃瓜果皮的Fv/Fm,先將黃瓜在黑暗環(huán)境中暗處理30 min,然后將黃瓜切成均勻的3個(gè)等份,取中間1等份用于測(cè)定Fv/Fm。

1.3.5 總可溶性固形物含量和總可溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 采用數(shù)顯折射儀測(cè)定黃瓜的總可溶性固形物含量,結(jié)果用百分比表示。

粗提取液的制備：取1 g已研磨好的黃瓜果皮樣品,加入5 ml 0.2 mol/L磷酸緩沖液[pH值為7.8,含有2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)],冰上渦旋混勻15 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。離心后得到的上清液即為粗提取液,用于總可溶性蛋白質(zhì)含量、超氧陰離子自由基(O2·-)產(chǎn)生速率和抗氧化酶活性的測(cè)定。

用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總可溶性蛋白質(zhì)含量[18],吸取0.05 ml粗提取液, 加入5 ml 0.1 mg/ml考馬斯亮藍(lán)溶液,室溫下反應(yīng)5 min。測(cè)定反應(yīng)液在595 nm處的吸光度,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃瓜果皮中的總可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.6 過(guò)氧化氫含量、超氧陰離子產(chǎn)生速率和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量的測(cè)定 過(guò)氧化氫(H2O2)含量的測(cè)定參考曹森等[19]的方法,O2·-產(chǎn)生速率的測(cè)定參考Ding等[20]的方法,丙二醛含量的測(cè)定參考Wen等[21]的方法。

1.3.7 抗氧化酶活性的測(cè)定 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定參考王靜等[22]的方法,過(guò)氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定參考Wang等[17]的方法,過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定參考Liang等[23]的方法。

1.3.8 總RNA的提取和基因表達(dá)分析 先用TRIzol試劑提取黃瓜果皮的總RNA[17]，再用iScript cDNA Synthesiskit(Bio-Rad,美國(guó))試劑盒合成cDNA第一鏈。用SYBR Green RT-PCR kit熒光染料試劑盒(Bio-Rad)、Bio-Rad iCyeler iQTM/Clooo儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析,具體步驟參照說(shuō)明書(shū)。所用引物序列等信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列等信息

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù),各指標(biāo)至少重復(fù)測(cè)定3次,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。用Excel 2003整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并作圖,用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 階段降溫處理對(duì)冷藏黃瓜冷害的影響

從圖1A可以看出,隨著冷藏時(shí)間的增加,黃瓜的冷害指數(shù)逐漸提高,表明黃瓜所受冷害的嚴(yán)重程度與低溫脅迫時(shí)間呈正相關(guān),即低溫脅迫時(shí)間越久,冷害越嚴(yán)重。對(duì)照組黃瓜于5 ℃冷藏3 d時(shí)就已經(jīng)觀察到了明顯的冷害癥狀,而階段降溫處理組黃瓜在冷藏6 d時(shí)才觀察到明顯的冷害癥狀。與對(duì)照相比,階段降溫處理顯著降低了黃瓜的冷害指數(shù)，在冷藏12 d時(shí),階段降溫處理組黃瓜的冷害指數(shù)比對(duì)照組低48.57%。

圖1B結(jié)果顯示,階段降溫處理組和對(duì)照組黃瓜的Fv/Fm在整個(gè)冷藏期間呈下降趨勢(shì),對(duì)照組的Fv/Fm在冷藏初期迅速下降,而階段降溫處理組的Fv/Fm變化趨勢(shì)較為平緩。冷藏12 d時(shí),階段降溫處理組黃瓜的Fv/Fm仍然保持在0.60以上,而對(duì)照組的Fv/Fm卻降低至0.23。與對(duì)照相比,階段降溫處理顯著提高了Fv/Fm;與冷藏起始階段(0 d)相比,經(jīng)過(guò)12 d的冷藏,階段降溫處理組的Fv/Fm只降低了15.32%,而對(duì)照組的Fv/Fm降低了67.85%,表明階段降溫處理有利于保持葉綠體形態(tài)的完整性。

由圖1C可見(jiàn),黃瓜果皮的相對(duì)電導(dǎo)率在整個(gè)冷藏期間的變化趨勢(shì)與冷害指數(shù)相似,均隨著冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高。與對(duì)照組相比,除冷藏0 d、9 d外,階段降溫處理組的相對(duì)電導(dǎo)率顯著低于對(duì)照組,比對(duì)照組低7.73%～20.42%。

產(chǎn)生冷害的果實(shí)組織往往已經(jīng)發(fā)生了一定程度的損傷,當(dāng)轉(zhuǎn)移到室溫貨架后,很容易受到環(huán)境中的致病菌侵染,導(dǎo)致冷害果實(shí)發(fā)生較為嚴(yán)重的次生病害[4]。因此，通過(guò)評(píng)價(jià)次生病害病情指數(shù),也可以間接反映冷藏果蔬所受冷害的嚴(yán)重程度[17]。從圖1D可見(jiàn),階段降溫處理組的次生病害病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組。在室溫(25 ℃)下貯藏4 d時(shí),對(duì)照組的次生病害病情指數(shù)為3.53,而階段降溫處理組的次生病害病情指數(shù)僅為1.60,比對(duì)照組低54.67%。

A:冷害指數(shù);B:PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率; C:相對(duì)電導(dǎo)率; D:次生病害病情指數(shù)。*表示階段降溫處理組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)。CII表示冷害指數(shù)，F(xiàn)v/Fm表示PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率，REC表示相對(duì)電導(dǎo)率，SDI表示次生病害病情指數(shù)。圖1 階段降溫處理對(duì)冷藏黃瓜冷害指數(shù)、Fv/Fm、相對(duì)電導(dǎo)率和次生病害病情指數(shù)的影響Fig.1 Effects of slowly cooling treatment on chilling injury index, Fv/Fm, relative conductivity and secondary disease index of cold-stored cucumber

2.2 階段降溫處理對(duì)冷藏黃瓜果皮總可溶性固形物含量和總可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

在逆境脅迫下,植物為了減輕由逆境脅迫造成的生理代謝失調(diào),其細(xì)胞會(huì)大量積累可溶性滲透物質(zhì),通過(guò)滲透調(diào)節(jié)來(lái)保持較高的滲透壓,從而保證細(xì)胞的正常生理活動(dòng)[24]，可溶性糖類(lèi)和可溶性蛋白質(zhì)便是重要的滲透物質(zhì)。由圖2A可見(jiàn),盡管階段降溫處理組與對(duì)照組的總可溶性固形物含量之間沒(méi)有顯著差異,但是階段降溫處理組的總可溶性固形物含量總體上高于對(duì)照組。與0 d時(shí)相比，階段降溫處理組的總可溶性固形物含量在整個(gè)冷藏期總體呈增加的趨勢(shì),而對(duì)照組的總可溶性固形物含量總體呈減少的趨勢(shì),表明階段降溫處理誘導(dǎo)了可溶性固形物的積累。從圖2B可見(jiàn),總可溶性蛋白質(zhì)含量在整個(gè)冷藏期間總體呈上升趨勢(shì),表明低溫會(huì)誘導(dǎo)不溶性蛋白質(zhì)向可溶性蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化,這可能是植物自我防御的結(jié)果。但是,除冷藏期的0 d、6 d外,階段降溫處理組的總可溶性蛋白質(zhì)含量明顯高于對(duì)照組,表明階段降溫處理對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)作用,從而顯著提高了總可溶性蛋白質(zhì)含量。

A:總可溶性固形物含量; B:總可溶性蛋白質(zhì)含量。*表示階段降溫處理組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)。圖2 階段降溫處理對(duì)冷藏黃瓜果皮總可溶性固形物含量和總可溶性蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of slowly cooling treatment on contents of total soluble solids and total soluble proteins in cold-stored cucumber peel

2.3 階段降溫處理對(duì)冷藏黃瓜果皮過(guò)氧化氫含量、超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率和丙二醛含量的影響

H2O2、O2·-是植物中2種主要的活性氧,低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致活性氧迸發(fā),進(jìn)而造成細(xì)胞的氧化損傷[25]。從圖3A可見(jiàn),在冷藏的0～9 d,H2O2含量總體呈增加趨勢(shì);在冷藏的前6 d,對(duì)照組與階段降溫處理組間的H2O2含量差異不明顯,但在冷藏的9 d和12 d,階段降溫處理組的H2O2含量明顯低于對(duì)照組。由圖3B可見(jiàn),對(duì)照組的O2·-產(chǎn)生速率變化趨勢(shì)與H2O2含量變化趨勢(shì)基本一致,隨冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高,而階段降溫處理組的O2·-產(chǎn)生速率呈波動(dòng)上升趨勢(shì),并且除冷藏0～3 d外,階段降溫處理組的O2·-產(chǎn)生速率明顯低于對(duì)照組?；钚匝鹾吭黾訒?huì)使細(xì)胞膜脂過(guò)氧化,降低細(xì)胞膜的流動(dòng)性,丙二醛是衡量膜脂過(guò)氧化的一個(gè)重要指標(biāo)[26]。從圖3C可以看出,丙二醛含量呈先增加后降低的趨勢(shì),對(duì)照組、階段降溫處理組均在冷藏后9 d達(dá)到最高值。在整個(gè)冷藏期間,階段降溫處理組的丙二醛含量均顯著低于對(duì)照組。上述結(jié)果一致表明,階段降溫處理有利于減少活性氧的產(chǎn)生,從而緩解了由低溫造成的氧化脅迫和氧化損傷。

A: H2O2含量; B: O2·-產(chǎn)生速率; C: 丙二醛含量。*表示階段降溫處理組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)。圖3 階段降溫處理對(duì)冷藏黃瓜果皮H2O2含量、O2·-產(chǎn)生速率和丙二醛含量的影響Fig.3 Effects of slowly cooling treatment on H2O2 content, O2·- production rate and malondialdehyde(MDA) content in cold-stored cucumber peel

2.4 階段降溫處理對(duì)冷藏黃瓜果皮抗氧化防御酶活性的影響

抗氧化系統(tǒng)是植物抵抗逆境脅迫的重要防御系統(tǒng),SOD、CAT和POD是植物清除活性氧的重要抗氧化防御酶[27]。從圖4A可以看出,CAT活性總體呈下降趨勢(shì),階段降溫處理組的CAT活性下降趨勢(shì)明顯低于對(duì)照組,且階段降溫處理組的CAT活性在冷藏6～12 d時(shí)顯著高于對(duì)照組;冷藏12 d時(shí),階段降溫處理組的CAT活性比對(duì)照組高25.82%。由圖4B可知,對(duì)照組CAT3基因相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與CAT活性變化趨勢(shì)一致,而階段降溫處理組的CAT3基因相對(duì)表達(dá)量先增加后降低,在冷藏3 d時(shí)達(dá)到峰值。除冷藏開(kāi)始時(shí)(0 d)與冷藏最后1 d,階段降溫處理組的CAT3基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。由圖4C可知,對(duì)照組的SOD活性緩慢增加,而階段降溫處理組的SOD活性在冷藏9 d達(dá)到最大值,隨后又降低。除冷藏3 d和12 d外,階段降溫處理組的SOD活性均顯著高于對(duì)照組。由圖4D可知,階段降溫處理組的SOD(Mn)基因相對(duì)表達(dá)量在冷藏前期急劇增加,在冷藏6 d達(dá)到峰值,但對(duì)照組的SOD(Mn)基因相對(duì)表達(dá)量在整個(gè)冷藏期間變化不大,整體呈下降趨勢(shì)。階段降溫處理組的SOD(Mn)基因相對(duì)表達(dá)量在冷藏3～9 d顯著高于對(duì)照組。由圖4E可見(jiàn),階段降溫處理組的POD活性整體呈上升趨勢(shì),而對(duì)照組的POD活性在冷藏3 d達(dá)到最大值，之后逐漸降低。在冷藏前期(0 d、3 d、6 d),階段降溫處理組的POD活性與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異,但在冷藏后期(9 d、12 d),階段降溫處理組的POD活性顯著高于對(duì)照組。由圖4F可知,POD1基因相對(duì)表達(dá)量先增加后降低,在冷藏6 d時(shí)達(dá)到峰值；與對(duì)照組相比,除冷藏0 d、12 d外,階段降溫處理組的POD1基因相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組。

綜合上述結(jié)果可知,無(wú)論是在酶活性層面還是在酶基因表達(dá)層面,階段降溫處理均增強(qiáng)了冷藏黃瓜的抗氧化能力,從而緩解了低溫脅迫導(dǎo)致的氧化損傷。

A:CAT活性; B:CAT3基因的相對(duì)表達(dá)量; C:SOD活性; D:SOD(Mn)基因的相對(duì)表達(dá)量; E:POD活性; F:POD1基因的相對(duì)表達(dá)量。*表示階段降溫處理組與對(duì)照組之間差異顯著(P<0.05)。CAT表示過(guò)氧化氫酶，SOD表示超氧化物歧化酶，POD表示過(guò)氧化物酶。圖4 階段降溫處理對(duì)冷藏黃瓜果皮CAT、SOD、POD活性和相應(yīng)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of slowly cooling treatment on activities of catalase(CAT), superoxide dismutase(SOD) and peroxidase(POD) and relative gene expression in cold-stored cucumber peel

3 討 論

黃瓜是冷敏型果蔬,在冷藏期間很容易發(fā)生冷害,黃瓜的冷害癥狀表現(xiàn)為果皮表面出現(xiàn)水漬狀凹陷斑等[3],通過(guò)統(tǒng)計(jì)并計(jì)算果皮水漬狀凹陷斑面積所占比例可反映黃瓜受到冷害的嚴(yán)重程度。葉綠素在綠色蔬菜中的含量很高,低溫脅迫等非生物脅迫通常會(huì)導(dǎo)致葉綠體降解,使葉綠素含量降低。因此,通過(guò)檢測(cè)葉綠素含量可間接反映植物受脅迫的嚴(yán)重程度。葉綠素?zé)晒鈪?shù)——PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)與葉綠素含量成正比,Fv/Fm可以用來(lái)衡量采后果蔬受到冷害的程度[28]。相對(duì)電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)之一,低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜喪失完整性,且冷害越嚴(yán)重,細(xì)胞膜的透性越大,相對(duì)電導(dǎo)率就越高[29]。將發(fā)生冷害的果實(shí)轉(zhuǎn)移至室溫時(shí),其抗病性降低,往往會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的次生病害,而這種次生病害癥狀極易被觀察,次生病害癥狀的嚴(yán)重程度可以更直觀地反映冷害的嚴(yán)重程度[30]。熱處理可誘導(dǎo)冷藏黃瓜的耐冷性,表現(xiàn)在熱處理的黃瓜冷害指數(shù)、相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低[3];貯前冷馴化也可以誘導(dǎo)冷藏黃瓜的耐冷性,表現(xiàn)在冷馴化能延緩Fv/Fm的下降、抑制次生病害病情指數(shù)提高[17]。在本研究中,階段降溫處理顯著降低了冷藏黃瓜的冷害指數(shù)、相對(duì)電導(dǎo)率和次生病害病情指數(shù),顯著延緩了Fv/Fm的下降。這些結(jié)果一致表明,階段降溫預(yù)冷處理誘導(dǎo)了冷藏黃瓜的耐冷性，也表明通過(guò)單一的溫度調(diào)節(jié)處理可以誘導(dǎo)冷藏黃瓜的耐冷性,這對(duì)于采后果蔬產(chǎn)業(yè)來(lái)說(shuō)具有重要意義。因?yàn)樵诓辉黾釉O(shè)備和不使用保鮮劑的情況下,通過(guò)階段降溫的方式處理果蔬，既能起到誘導(dǎo)果蔬耐冷性，控制冷害的作用,又能與預(yù)冷處理相結(jié)合,達(dá)到預(yù)冷的效果,并且不會(huì)增加采后處理的生產(chǎn)成本,有利于提高采后黃瓜的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。

滲透調(diào)節(jié)是植物細(xì)胞保持正常生理活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,低溫脅迫會(huì)使?jié)B透物質(zhì)如可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)的含量增加,滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量高通常意味著采后果蔬對(duì)低溫的耐受能力強(qiáng)[31]。NO處理能夠減輕冷藏哈密瓜冷害與總可溶性固形物含量維持在較高水平有關(guān)[32]。在本研究中，階段預(yù)冷處理組的總可溶性固形物含量和總可溶性蛋白質(zhì)含量高于對(duì)照組,與王霞等[32]的研究結(jié)果一致,表明階段降溫處理誘導(dǎo)了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累,提高了細(xì)胞內(nèi)的滲透勢(shì),這可能是階段降溫處理組黃瓜耐冷性更強(qiáng)的重要原因。

低溫脅迫通常會(huì)引起活性氧大量產(chǎn)生,隨后引發(fā)一系列反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性喪失,丙二醛含量反映了細(xì)胞膜的膜脂過(guò)氧化程度[30]。冷害導(dǎo)致冷藏黃瓜活性氧含量突增,造成細(xì)胞膜脂過(guò)氧化,進(jìn)而引起丙二醛含量的增加[33]。腐胺處理降低了香蕉果實(shí)活性氧含量和丙二醛含量,提高了細(xì)胞膜完整性,降低了膜脂過(guò)氧化程度,從而增強(qiáng)了采后香蕉的耐冷性[34]。在本研究中,階段降溫處理降低了2種主要活性氧(H2O2和O2·-)含量和丙二醛含量,降低了相對(duì)電導(dǎo)率,表明階段降溫處理通過(guò)降低活性氧含量減輕了冷藏黃瓜細(xì)胞膜的氧化損傷,進(jìn)而保持了細(xì)胞膜的完整性。

活性氧積累引起的氧化脅迫是冷藏果蔬發(fā)生冷害的重要原因,由于活性氧產(chǎn)生和清除之間的動(dòng)態(tài)平衡被破壞,使冷藏果蔬的冷害程度加劇。CAT、SOD和POD是清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的重要抗氧化酶[27]。已有研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化防御酶的活性與耐冷性呈正相關(guān),即抗氧化酶活性越高,耐冷性越強(qiáng)[34]。本研究得到了相似的結(jié)果,即黃瓜耐冷性強(qiáng)的階段降溫處理組SOD活性、CAT活性和POD活性大都高于對(duì)照組,表明階段降溫處理提高了冷藏黃瓜的抗氧化酶活性。較高活性的抗氧化酶能及時(shí)清除產(chǎn)生的活性氧,這也解釋了階段降溫處理組的H2O2含量、O2·-含量低于對(duì)照組的原因。采后黃瓜經(jīng)階段降溫處理后,CAT3、SOD(Mn)和POD1基因的相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)了1個(gè)誘導(dǎo)峰,而對(duì)照組卻沒(méi)有,表明階段降溫處理誘導(dǎo)了CAT3、SOD(Mn)和POD1基因的表達(dá),從基因?qū)用孀C實(shí)了階段降溫處理誘導(dǎo)了冷藏黃瓜的耐冷性;同時(shí),在冷藏3～9 d,階段降溫處理組的CAT3、SOD(Mn)和POD1基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照組。這些結(jié)果很好地解釋了階段降溫處理組抗氧化酶活性較高的原因。

綜上所述,階段降溫處理可誘導(dǎo)采后黃瓜的耐冷性,減輕黃瓜的冷害癥狀,從而延長(zhǎng)黃瓜的貯藏期。階段降溫處理通過(guò)誘導(dǎo)滲透物質(zhì)積累及抗氧化系統(tǒng)相關(guān)酶活性,增強(qiáng)了冷藏黃瓜對(duì)低溫脅迫的耐受性,進(jìn)而延緩了黃瓜在冷藏期間冷害的發(fā)生。