劉恒恒，吳子健，董世瑞，張宏宇，王素英

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

微藻作為在全球經(jīng)濟(jì)中未被充分利用的可再生資源，具有生長快、固碳效果好和生長條件簡單等諸多優(yōu)點(diǎn)。微藻因其高營養(yǎng)價(jià)值而廣泛應(yīng)用于食品加工及水產(chǎn)餌料，不僅能夠提高產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值還能緩解糧食壓力。多種微藻含有豐富的生物活性物質(zhì)[1-3]，如維生素、藻藍(lán)蛋白、不飽和脂肪酸和微藻多糖等，微藻及其代謝產(chǎn)物具有增強(qiáng)人體免疫力、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗腫瘤及病毒等保健功效[4]，這使得開發(fā)微藻保健品、特色食品極具潛力。

微藻的生長可以用SLogistic曲線進(jìn)行描述，SLogistic曲線又稱S型生長曲線[5]，微生物種群增長、陸生及水生動(dòng)物種群增長、細(xì)胞生長[6-7]等過程均可用其描述。完整的微生物生長曲線包括漸增期、快增期、緩增期和衰減期4個(gè)時(shí)期[8]。用OriginPro8.0中的SLogistic1模型對微藻生長數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合可以得到擬合度較高的生長曲線，該模型引入最大生長速率以及終止生物量，能準(zhǔn)確、定量地描述生物生長規(guī)律。擬合生長曲線可以呈現(xiàn)出藻種狀態(tài)[9]，整體把握藻種活力以及再生長情況。

經(jīng)濟(jì)微藻的研究與養(yǎng)殖離不開藻種保藏，最常用的保藏方法是液體藻種保藏法，當(dāng)微藻種類較多時(shí)會出現(xiàn)占用空間大且傳代頻繁的缺點(diǎn)[10]；超低溫冷凍保藏法需要進(jìn)行多步驟預(yù)冷且只適合于幾種特殊的藻類[11]。在此基礎(chǔ)上改良的濃縮液普通低溫保藏法常常應(yīng)用于微藻餌料的貯藏，但對于微藻是否能夠存活以及存活藻種的活力并無要求[12]。為了提高微藻的存活率，在現(xiàn)有的濃縮藻液低溫保藏條件中加入弱光照及合適的保護(hù)劑。研究表明新生態(tài)藻絲體更適應(yīng)于在弱光照條件下存在[13]。弱光照條件不僅能夠維持藻種的形態(tài)，還可以降低藻細(xì)胞的死亡率。而保護(hù)劑可以降低藻細(xì)胞由低溫帶來的冷損害，提高藻種質(zhì)量和存活率。海藻糖可以在低溫、高溫以及干燥脫水等逆境脅迫條件下防止蛋白質(zhì)變性，通過水分子置換以及穩(wěn)定化學(xué)物質(zhì)來減少細(xì)胞所受到的危害[14-15]。本試驗(yàn)根據(jù)節(jié)旋藻及螺旋藻的生長特性，在濃縮藻液低溫保藏法的基礎(chǔ)上，增添海藻糖保護(hù)劑與弱光照，以保藏時(shí)間長、菌種活力好以及菌種取用方便為原則優(yōu)化保藏條件，克服常溫繼代保藏方法頻繁傳代、占用較多原材料及存儲空間大的缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藻株：節(jié)旋藻 TJJ2、F-792、TJSD1、TJBC14-2、TJJ1、F-900-1、TJBC1、TJJ3 和螺旋藻 F-1070、F-351[16]，由天津商業(yè)大學(xué)王素英課題組保存。

海藻糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；碳酸鎂（配制0.1%懸浮液）、丙酮（配制90%溶液）：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；AB培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)[17]進(jìn)行配制。

1.2 儀器與設(shè)備

DG-486B低溫光照保藏柜：天津世紀(jì)茂源機(jī)械有限公司；Micro17臺式高速離心機(jī)：賽默飛世爾科技有限公司；U-5100分光光度計(jì)：日本Hitachi公司；AS823分體式光照度計(jì)：東莞?，攦x表萬創(chuàng)電子制品有限公司；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMY公司；TWS-16單列六孔電熱恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)電爐有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藻種耐低溫性測定

將OD560nm≈0.8的10株藻種按照5%接種量接種，兩周后分別取原藻液和5倍藻濃縮液放置于4℃保藏柜中自然光可照射范圍，每10 d取樣活化，比較死亡時(shí)間，選取相對耐低溫的藻株進(jìn)行保藏條件優(yōu)化。

1.3.2 低溫弱光保藏正交試驗(yàn)

1.3.2.1 海藻糖濃度選擇

設(shè)置海藻糖保護(hù)劑的質(zhì)量濃度為0.2%、1%、5%、15%，無菌環(huán)境下與AB培養(yǎng)基混合獲得海藻糖保藏液。藻種濃縮液用海藻糖保藏液稀釋至濃度為4×106CFU/mL，放置于4℃保藏柜中自然光可照射范圍，保藏2個(gè)月后活化藻種檢測藻種活力，進(jìn)行活力指標(biāo)的評價(jià)后選擇海藻糖保護(hù)劑合適的濃度范圍以進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以海藻糖濃度、藻液濃度及光照強(qiáng)度為考察因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交表[18]見表1。

表1 藻種保藏因素和水平表Table 1 Factors and levels of microalgae preservation

根據(jù)正交設(shè)計(jì)結(jié)果設(shè)置對應(yīng)條件進(jìn)行藻種保藏，在保藏 2、3、4、5、6 個(gè)月時(shí)檢測藻種活力。

1.3.2.3 藻種保藏方法

以相對耐低溫藻株為試驗(yàn)材料，在其OD560nm≈0.8時(shí)以5%接種量接種，兩周后將藻液12 000 r/min離心10 min獲得藻泥，用不同濃度的海藻糖保藏液稀釋藻泥，血球計(jì)數(shù)板測定并計(jì)算藻液濃度，稀釋至所需濃度，取4 mL藻液于10 mL保藏管中，置于相應(yīng)條件下進(jìn)行保藏。

1.3.2.4 保藏藻種的活化

在相應(yīng)保藏時(shí)間下將保藏藻種接種于150 mL AB培養(yǎng)基中進(jìn)行活化生長，藻液濃度為 2×106、3×106、4×106CFU/mL的保藏藻種對應(yīng)的接種量分別為400、270、200 μL，生長條件為光照 12 h（32 ℃）、黑暗 12 h（30℃）。采用濁度法在第 0、3、5、7、9、11、13 天測定保藏藻種活化后生長的生物量（OD560nm）。

1.3.3 Origin Pro擬合生長曲線

以時(shí)間（天數(shù)）為自變量（X）、生物量（OD560nm）為因變量（Y），在 Origin Pro 8.0中對其進(jìn)行 SLogistic1（SLogistic模型同系列的近似模型）的生長曲線擬合，得到高擬合度的生長曲線及相應(yīng)函數(shù)。

對生長曲線函數(shù)進(jìn)行一階求導(dǎo)并繪圖，得到生長速率曲線圖，可求出藻種的最大生長速率（0≤X≤13 d）。對生長速率進(jìn)行二階求導(dǎo)得到生長速率函數(shù)的兩個(gè)拐點(diǎn)，兩拐點(diǎn)對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)將生長曲線的生長過程分為漸增期、快增期和緩增期3個(gè)階段[19]。在對應(yīng)的保藏時(shí)間下，統(tǒng)計(jì)組內(nèi)的漸增期、快增期、緩增期、生物積累量、最大生長速率、最大生長速率發(fā)生時(shí)間指標(biāo)，并確定可以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的特征指標(biāo)，以評價(jià)保藏藻種活力。

1.3.4 正交試驗(yàn)的極差與方差分析

在相應(yīng)的保藏時(shí)間下，以特征指標(biāo)為統(tǒng)計(jì)對象，對邊際均值進(jìn)行估算，通過均值極差法計(jì)算試驗(yàn)中各因素各水平對應(yīng)的均值（K）和極差（R），比較得出的各保藏因素的重要程度，并根據(jù)K值選出組內(nèi)最佳保藏條件。同時(shí)對主體間效應(yīng)進(jìn)行F檢驗(yàn)，選擇置信區(qū)間0.95，將各項(xiàng)數(shù)據(jù)結(jié)果的總變異分解為來源于不同因素的變異估計(jì)值，以評定出各因素在總變異中所占的相對重要性[20]。

1.3.5 葉綠素a含量的測定

參考文獻(xiàn)[21]采用濁度法在測定生物量的同時(shí)測定藻體葉綠素a含量，葉綠素a濃度計(jì)算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件和Oringin8.0繪圖軟件進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理、顯著性分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藻種耐低溫性檢測

藻種耐低溫性能的試驗(yàn)結(jié)果見圖1。

由圖1可知，在低溫自然光條件下保藏時(shí)，濃縮藻液較原藻液的保藏時(shí)間更長；其中F-1070和TJBC14-2的原液和濃縮液在低溫下存活時(shí)間都超過60 d，但TJBC14-2在低溫下生理代謝受到影響，較易出現(xiàn)異腥味，低溫弱光保藏后進(jìn)行活化藻結(jié)塊嚴(yán)重；F-1070沒有明顯的異味和結(jié)塊，較適合低溫保藏，因此選擇螺旋藻F-1070用于隨后的低溫弱光保藏試驗(yàn)。

圖1 試驗(yàn)藻種耐低溫性能的試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Experimental results of low temperature resistance of microalgae species

2.2 低溫弱光保藏正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 海藻糖濃度范圍的選擇

不同濃度海藻糖對生長速率與漸增期時(shí)間的影響見圖2與圖3。

圖2 不同濃度海藻糖對生長速率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of trehalose on the growth rate

圖3 不同濃度海藻糖對漸增期時(shí)間的影響Fig.3 Effects of different concentrations of trehalose on the delayed growth period

由圖2與圖3可知，不同濃度海藻糖對藻種保藏效果有較大影響，在海藻糖濃度為5%和15%時(shí)，保藏藻種F-1070的生長速率高于對照組，漸增期時(shí)間少于對照組，因此選擇海藻糖濃度范圍為5%～15%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2.2 正交試驗(yàn)表

利用SPSS 19.0實(shí)現(xiàn)的正交設(shè)計(jì)表見表2。

表2 在SPSS中實(shí)現(xiàn)的正交設(shè)計(jì)表Table 2 Orthogonal design implemented in SPSS

2.3 擬合生長曲線結(jié)果

2.3.1 SLogistic模型的選擇

SLogistic模型所對應(yīng)的假設(shè)條件是在有限的生物資源條件下單個(gè)微生物生長具有相同的增長率，且所需營養(yǎng)相同[22]。把增長率dy/dx與任意時(shí)間的種群生物量y（x）聯(lián)系在一起，典型的SLogistic模型可以表示為：

式中：k為常數(shù)；a為環(huán)境容納最大生物容量，本試驗(yàn)以吸光度定義，即該生物生長過程中所能達(dá)到的OD560nm峰值。

其模型所包含的內(nèi)在機(jī)制為：（1）隨著y逐漸增長到 a 過程中，未知利用“剩余空間”（y/a）逐漸減少；（2）種群增長率先由小變大，到曲線中點(diǎn)即生長轉(zhuǎn)折點(diǎn)（a/2）最大，然后逐漸減少，當(dāng)達(dá)到最大生物容量時(shí)，增長率趨于零。

SLogistic1模型是SLogistic模型的近似模型，其曲線相比于SLogistic曲線具有更加清晰的3個(gè)生長階段，其快增期更加陡峭?？紤]到微藻的生長具有更明顯的快增期，因此SLogistic1曲線更適合描述微藻的生長規(guī)律。SLogistic1模型可以表示為：

其中最大值及發(fā)生時(shí)間為：

SLogistic1曲線的特點(diǎn)是隨X增加，Y值開始增長緩慢，而在以后的某一范圍內(nèi)迅速增長，X達(dá)到某限度后，Y增長趨于緩慢，整個(gè)曲線略呈陡峭的“S”型，兩條漸近線分別為Y=a和Y=0，a值的物理意義是Y所能達(dá)到的最大值，k和XC為Slogistic1曲線方程的特征參數(shù)。采用SLogistic1模型進(jìn)行保藏藻種再生長曲線的擬合，分析可得生長曲線所包含的漸增期、快增期、緩增期以及生長轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

以保藏藻株F-1070（編號1-2-2）保藏兩個(gè)月時(shí)為例，活化再生長后的再生長擬合曲線及生長速率曲線見圖4。

圖4 正交試驗(yàn)藻種的再生長擬合曲線及生長速率曲線Fig.4 Regrowth fitting curve and growth rate curve of the orthogonal test

由圖4可知，保藏藻株F-1070（編號1-2-2）保藏兩個(gè)月時(shí)活化再生長后的SLogistic1擬合生長曲線擬合度較好，其中虛線曲線為擬合的生長曲線Y（X）（0≤X≤13 d），實(shí)線曲線為生長速率曲線 R（X）（0≤X≤13d），R（X）峰值為最大生長速率。對 R（X）二階求導(dǎo)得到其兩拐點(diǎn)（R1，X1）、（R2，X2），X1、X2將整個(gè)生長曲線周期分為漸增期、快增期和緩增期，函數(shù)模型擬合的曲線具有Y=a的漸近線，因此曲線不包含生物量下降的衰亡期。

2.3.2 藻種活力評價(jià)體系的構(gòu)建

對SLogistic1模型擬合再生長曲線方程參數(shù)[22]的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

由表3可知，隨著保藏時(shí)間延長，一般情況下保藏菌種的活力減小，最大生物容量a值逐漸變小；下劃線標(biāo)注的模型預(yù)測指標(biāo)a值出現(xiàn)異常，明顯偏大，這可能是因?yàn)樵宸N活力較弱，因此再生長過程中漸增期明顯延長即生長周期的延長，檢測時(shí)間占整個(gè)生長周期的比例減小，造成擬合曲線預(yù)測性指標(biāo)的準(zhǔn)確性下降，但實(shí)際檢測所得數(shù)據(jù)仍準(zhǔn)確。這表明當(dāng)藻種活力較弱時(shí)，運(yùn)用擬合模型應(yīng)適當(dāng)延長檢測的時(shí)間范圍以獲得更加豐富的數(shù)據(jù)用來準(zhǔn)確的預(yù)測生長規(guī)律。

表3 SLogistic1模型對再生長曲線的擬合結(jié)果Table 3 The fitting results of SLogistic1 model to the regrowth curve

2.4 極差分析及SPSS分析

本試驗(yàn)中藻種活力評價(jià)體系所包含的特征指標(biāo)為漸增期時(shí)間、生物積累量、檢測范圍內(nèi)的最大生長速率（0≤X≤13 d）。在對SLogistic1擬合生長曲線的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，由于一部分生長曲線未能全部覆蓋快增期和緩增期，因此對于快增期時(shí)間、生長速率峰值、生長速率峰值真實(shí)發(fā)生時(shí)間都不能得到完整真實(shí)的統(tǒng)計(jì)。發(fā)生這種現(xiàn)象可能也是由于隨著保藏時(shí)間的延長，藻種活力逐漸下降，漸增期逐漸延長，僅測定兩周的生長狀態(tài)無法使生長曲線包含完整的快增期，因此在統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)時(shí)導(dǎo)致擬合生長曲線所展示的生長速率最大值并不是生長速率曲線的峰值，而是擬合速率曲線在X∈[0，13]時(shí)的最大值。求各個(gè)特征指標(biāo)2～6個(gè)月的均值，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并進(jìn)行極差與正交分析。

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4，對生物積累量、最大生長速率與漸增期時(shí)間的極差分析結(jié)果分別見表5、表6與表7。

由極差分析表可知，3種因素對生物積累量影響大小依次是：海藻糖濃度＞光照強(qiáng)度＞藻液濃度，均值（K）可得最優(yōu)組合為A2B3C3；對最大生長速率影響大小依次是：光照強(qiáng)度＞藻液濃度＞海藻糖濃度，均值可得最優(yōu)組合為A1B3C3；對漸增期時(shí)間影響大小依次是：藻液濃度＞海藻糖濃度＞光照強(qiáng)度，均值可得最優(yōu)組合為A2B3C2（漸增期越小表明藻種保藏結(jié)果越好）。方差分析結(jié)果表示在a=0.05水平下，3個(gè)因素對3個(gè)評價(jià)指標(biāo)均未達(dá)到顯著水平。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results

表5 生物積累量的極差分析數(shù)據(jù)表Table 5 Variance analysis data table of biological accumulation amount

表6 最大生長速率的極差分析數(shù)據(jù)表Table 6 Variance analysis data table of maximum growth rate

表7 漸增期時(shí)間的極差分析數(shù)據(jù)表Table 7 Variance analysis data table of delayed growth period

綜合藻種活力評價(jià)體系的特征指標(biāo)的分析結(jié)果可以看出：螺旋藻F-1070以海藻糖保護(hù)劑進(jìn)行低溫弱光保藏時(shí)的保藏條件最優(yōu)組合為A1/2B3C2/3，藻液濃度 2×106CFU/mL～4×106CFU/mL 以 15%濃度的海藻糖做保護(hù)劑，于弱光照下保藏（保藏箱恒溫4℃），進(jìn)行再生長的螺旋藻F-1070在第13天的生物積累量較高，同時(shí)漸增期更為短暫，能夠更快地步入快增期階段，且具有更大的生長速率峰值，這有利于生物量的積累，也表明在藻種活力方面明顯更具有優(yōu)勢，相比于其他條件組合更為理想。

2.5 葉綠素a含量分析

葉綠素a變化趨勢見圖5。

由圖5可知，光照對螺旋藻的生理狀態(tài)有著較為明顯的影響[23]，葉綠素a的合成與代謝能力與光照相關(guān)[24]。對再生長藻種進(jìn)行葉綠素a的測定，計(jì)算2～6個(gè)月每組的葉綠素a均值，作圖并比較結(jié)果，結(jié)果顯示編號3-3-2、1-3-3的葉綠素a含量在整個(gè)生長周期中都有著較為明顯的優(yōu)勢，而編號3-2-1、1-1-1的葉綠素含量較低，前者共同特點(diǎn)是具有15%的海藻糖保護(hù)劑以及弱光照條件，后者不具有光照條件且海藻糖濃度較低。這一結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果一致，表明光照是以海藻糖為保護(hù)劑的低溫弱光保藏中重要的因素，影響藻種F-1070的菌種保藏效果。

圖5 葉綠素a變化折線圖Fig.5 Broken line diagram of chlorophyll a change

3 結(jié)論與討論

通過藻種的耐低溫性測定試驗(yàn)選取螺旋藻F-1070，作為低溫弱光保藏試驗(yàn)的試驗(yàn)藻種，進(jìn)一步對添加海藻糖保護(hù)劑的濃縮藻液的低溫弱光保藏法進(jìn)行正交試驗(yàn)以優(yōu)化保藏條件。通過對正交試驗(yàn)藻種的再生長結(jié)果進(jìn)行生長曲線擬合與分析，統(tǒng)計(jì)特征指標(biāo)后建立以生物積累量、最大生長速率以及漸增期時(shí)間為指標(biāo)的評價(jià)體系，結(jié)果表明以海藻糖為保護(hù)劑時(shí)的低溫弱光保藏的較優(yōu)保藏條件為：濃縮藻液以15%的海藻糖濃度在弱光照下保藏，相應(yīng)的藻株保存6個(gè)月仍保持良好的活力。

本試驗(yàn)在研究低溫弱光保藏的方法中，初步了解藻液濃度、保護(hù)劑種類、海藻糖濃度和光照強(qiáng)度對保藏效果的影響。單就弱光照這一保藏條件來看，結(jié)果與尤珊[8]試驗(yàn)結(jié)果一致，即弱光照有利于微藻在低溫下保藏。海藻糖作為保護(hù)劑的保藏結(jié)果與王永紅等[25]一致，表明海藻糖作為保護(hù)劑，可以提高菌種保藏質(zhì)量。SLogistic模型對于微藻的生長可以有一個(gè)較為完整的描述，通過對利用模型擬合的生長曲線的分析與比較，能夠較為準(zhǔn)確的把握菌種活力、細(xì)胞生長狀態(tài)，通過對比分析特征指標(biāo)從而評價(jià)菌種質(zhì)量，或是應(yīng)用于生產(chǎn)中作為初步判斷生產(chǎn)質(zhì)量的簡易有效的測評方法。目前，螺旋藻的低溫弱光保藏法相關(guān)的研究較少，本試驗(yàn)的藻種低溫弱光保藏相比于閻斌倫等[26]的低溫弱光保藏法保藏時(shí)間更長，菌種活力更好。本試驗(yàn)為今后選擇更適合于螺旋藻不同藻種的普適性方法做出了初步研究，并且該保藏方法保存體積小、占用空間少、取用方便，適用于保存菌種較多、不定期取用、長時(shí)間保存的情況。