李金河，張 霞，王 琦，陳 迪，賈 峰，梁 贏，王金水

河南工業(yè)大學 生物工程學院，河南 鄭州 450001

小麥是世界上種植廣泛、食用人口眾多的糧食作物之一，小麥的種植幾乎遍布我國各地,其2019年產量達到了13 106萬t，約占我國年糧食總產量的1/5，與人們的健康生活息息相關[1]。面粉的加工特性在很大程度上取決于小麥粉在加入水混合后形成面團時的相互作用及形成的面筋蛋白的組成[2-3]。所有的小麥都含有醇溶蛋白和麥谷蛋白，它們一起形成面筋蛋白。也有研究表明，總蛋白的含量、醇溶蛋白與麥谷蛋白的比例以及亞組分的組成在決定最終面筋蛋白的性質方面都有一定的作用[4]。

面筋聚集儀是一種運用高剪切力來迅速檢測面筋蛋白在面粉和水的懸浮液體系中的聚集行為，從而判斷所形成面筋質量的儀器。它不僅能夠預測普通小麥面粉吸水率、面團混合穩(wěn)定性、韌性和延伸性等一些常規(guī)流變學特性指標，還可用于鑒別面筋蛋白品質，快速提供面筋品質信息[5]。Rakita等[6]通過面筋聚集儀來預測面包的品質；Marti等[7]也通過面筋聚集儀來確定面筋聚集特性與小麥品質相關蛋白組分含量的相關性。

在面團混合過程中加入小分子還原劑GSH能夠導致麥谷蛋白大聚體解聚，從而降低強筋面團的延展性，引起面包體積增加[8]。Lagrain等[9]的研究證明GSH的添加對麥谷蛋白混合后的提取率沒有影響，面包體積無顯著變化。前人的研究也表明,GSH會優(yōu)先與低分子量的游離巰基(如LMW-GS)反應形成穩(wěn)定的二硫鍵[10-11]。雖然針對GSH對蛋白質性質的影響的研究已有相關報道，但是其對面筋蛋白聚集特性的影響機制尚不明確。因此，作者利用面筋聚集儀快速分析了二硫鍵還原劑GSH對小麥粉面筋蛋白聚集特性的影響，并通過檢測小麥蛋白質中二硫鍵及游離巰基含量來分析GSH影響面筋聚集特性的分子機制。本研究可為小麥粉面筋聚集特性的研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

小麥樣品是購買自當?shù)厥袌龅男率斋@無蟲害鄭麥136號，于4 ℃環(huán)境中保存。

1.1.2 試驗試劑

EDTA(乙二胺四乙酸)、DTNB(5，5′-二硫代-2-硝基苯甲酸)、Urea(尿素)、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、Glycine(甘氨酸)、無水氯化鈣：分析純；GSH(還原型谷胱甘肽)、GSSG(氧化型谷胱甘肽)：食品級。

Tris-Gly緩沖液：每升溶液中含有10.4 g Tris、6.9 g Gly、1.2 g EDTA，pH=8.0。

緩沖溶液A：8 mol/L尿素、3 mol/L EDTA、0.01 g/mL SDS和0.2 mol/L Tris-HCl，pH=8.0。

緩沖溶液B：10 mmol/L DTNB、0.2 mol/L Tris-HCl，pH=8.0。

緩沖溶液C：8 mol/L尿素、3 mol/L EDTA、0.01 g/mL SDS、0.1 mol/L Na2SO3、0.5 mmol/L NTSB2-和0.2 mol/L Tris-HCl，pH=9.5。

NTSB2-的合成方法：100 mg的DTNB溶解到10 mL 1 mol/L的亞硫酸鈉中，同時調節(jié)pH=7.5，38 ℃水浴并通氧氣直至亮紅色變成淡黃色溶液，證明NTSB2-已經形成。

緩沖溶液D：8 mol/L尿素、3 mol/L EDTA、0.01 g/mL SDS、0.1 mol/L Na2SO3、0.2 mol/L Tris-HCl，pH=8.0。

1.2 主要儀器與設備

BSA223S電子分析天平:賽多利斯科學儀器有限公司；101 A-2電熱鼓風干燥箱:上海實驗儀器廠有限公司；LFP-800 A高速多功能粉碎機:無錫錫糧機械制造有限公司；面筋聚集儀:德國Brabender公司；METTLER TOLEDO pH計：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 制粉

按照 GB/T 20571—2006方法測定小麥籽粒的原始水分，并根據籽粒原始水分含量和期望水分含量確定潤麥加水量，將小麥水分含量調節(jié)到規(guī)定的要求，潤麥水分 15%，潤麥時間 24 h，潤好后的小麥立即用LFP-800 A粉碎機打粉，過80目篩后的面粉裝入自封袋中密封，在冰箱(4 ℃)中保存。

1.3.2 小麥粉水分含量的測定

參照GB 5009.3—2016中的方法。

1.3.3 小麥粉面筋聚集特性的測定

根據Melnyk等[4]和Rakita等[6]的研究，使用面筋聚集儀對小麥粉面筋聚集特性進行測定。首先分別將GSH以0.06、0.12、0.24、0.36、0.48 mg/g的比例，GSSG以0.12、0.36 mg/g的比例加入到所制小麥粉中。將8.5 g 面粉分散在9.5 g水中，以水分含量14%為基礎將水和面粉的質量按比例調節(jié)，以保持液固比(1.26)恒定。通過夾套樣品杯循環(huán)水將樣品溫度保持在34 ℃,將槳葉設置為1 900 r/min，并進行7 min的樣品測試。對每個樣品進行評價,指標如下：峰值最大時間(PMT)、峰值扭矩(MT)、聚集能(AgE)(最大扭矩前15 s和最大扭矩后15 s與曲線圍成的面積)，最大扭矩120 s后扭矩減小量(LT120)。

1.3.4 面粉與水混合后懸浮液中蛋白質中游離巰基及二硫鍵含量的測定[12-14]

參照陳萬義等[14]的方法并做適當?shù)男薷?。取面粉與溶液混合并攪拌至面筋起始聚集時間點(LOT)時的懸浮物0.25 g，加入2 mL Tris-Gly緩沖液后振蕩15 s，以10 000 r/min離心5 min，倒出上清，向沉淀中再次加入1 mL Tris-Gly緩沖液，振蕩均勻后以10 000 r/min離心5 min，保留沉淀。

蛋白質中游離巰基含量的測定：往所得沉淀中加入2.7 mL 緩沖液A，在室溫下，先劇烈振蕩30 s，接著繼續(xù)緩慢振蕩1 h, 再往其中加入0.3 mL 緩沖液B，在室溫下繼續(xù)振蕩1 h，平衡后，12 000 r/min離心5 min，在412 nm處測定上清液吸光度。游離巰基含量計算公式：

A=εbc，

式中:A為光吸收值；ε(摩爾消光系數(shù))=13 600 mol-1·L·cm-1；b為比色皿的厚度，cm；c為待測溶液中游離巰基的濃度,mol/L。

蛋白質中總巰基含量的測定：往所得沉淀中加入3 mL 緩沖液C，在室溫下，先劇烈振蕩30 s，接著繼續(xù)緩慢振蕩1 h，然后12 000 r/min離心5 min，吸取0.1 mL上清液，再往其中加入0.9 mL緩沖溶液D，混合均勻后在 412 nm 處測吸光度。二硫鍵含量的計算公式：

SS=TS-SH，

式中:SS為二硫鍵的含量,μmol·L-1；TS為測定總巰基的含量,μmol·L-1；SH為游離巰基的含量,μmol·L-1。

1.3.5 數(shù)據處理

所有試驗均進行3次重復，采用微軟Excel 2010和SAS 9.0 對數(shù)據進行處理和顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 還原劑對小麥粉面筋聚集特性影響

圖1為小麥面粉的面筋聚集特性曲線，所示面筋聚集特性曲線相關的參數(shù)列于表1中。在試驗過程中，樣品與水的混合液受到強烈的機械作用，在旋轉元件的高速推動下，形成面筋網絡，并且記錄到扭矩曲線急劇升高。進一步的混合破壞了面筋網絡，轉矩曲線下降。通常峰值時間和聚集時間是谷蛋白聚集動力學的指標，與蛋白質和面筋含量呈負相關，即隨著蛋白質和面筋含量的增加，PMT下降，且反映小麥面筋網絡強度指標的峰值扭矩和聚集能與蛋白質和濕面筋含量呈正相關[6,15]。從圖1及表1可以看出，隨著GSH添加量的增加，PMT逐漸減小，MT卻并沒有增大，說明面筋聚集曲線PMT的提前并不是由蛋白質或濕面筋含量的增加而導致的。有報道稱品質差的面粉的特點是稠度迅速增加，隨后迅速分解，面筋的聚集時間較短，而強筋面粉的面團稠度增加速度相對較慢，達到峰值稠度需要更多時間[16]，從圖1可以看出，隨著GSH添加量的增加，面筋的聚集時間逐漸縮短，說明隨著GSH添加量的增加，面粉品質在逐漸變差。從表1也可以看出，隨著還原劑GSH添加量的增加，小麥粉的面筋聚集能逐漸減小，LT120卻逐漸增加，說明GSH的加入破壞了面筋蛋白網絡結構，使其穩(wěn)定性顯著下降。

圖1 不同含量的GSH處理后小麥粉面筋聚集特性曲線

表1 不同含量的GSH處理后小麥粉面筋聚集特性的變化

2.2 小麥粉在GSSG處理后面筋聚集特性的變化

經過前處理的面粉和蒸餾水混合后在高速攪拌條件下，面筋組分在高剪切力的作用下被分離出來，然后發(fā)生聚集形成均勻的面筋網絡結構[17]。從圖2和表2可以看出，GSSG與GSH存在時面筋聚集特性的變化趨勢顯著不同。在兩種含量的GSSG存在時，面筋的峰值最大時間與對照組相比并沒有顯著變化，僅表現(xiàn)為面筋聚集能下降，最大扭矩120 s后扭矩的減小量增加，說明GSSG的加入僅對面筋的穩(wěn)定性有顯著性影響。表明GSSG主要在蛋白質的重組過程中，即在面筋蛋白聚合的過程中參與反應，在蛋白質的解聚分離過程中不參與反應，從而僅表現(xiàn)為面筋網絡結構的穩(wěn)定性下降。也說明了面粉中加入的GSH參與了初始攪拌過程中面粉中蛋白質的解聚分離過程，從而改變了面粉的面筋聚集特性，使面筋的聚集時間縮短，PMT提前。

圖2 不同含量的GSSG處理后小麥粉面筋聚集特性曲線

表2 不同含量的GSSG處理后小麥粉面筋聚集特性的變化

2.3 GSH處理后總蛋白中游離巰基的含量變化

從圖3可以看出，GSH處理后的面粉與蒸餾水混合后，在攪拌至面筋起始聚集時間點(LOT)時的懸浮液中蛋白質所含有的游離巰基含量隨著GSH添加量的增加而逐漸增加，表明GSH的加入在蛋白質解聚分離的過程中破壞了蛋白質間的二硫鍵。因此，結合2.2中的分析，可以認為GSH的加入，促進了蛋白質間二硫鍵的斷裂，加速了面粉中蛋白質的解聚分離過程，從而使PMT提前。形成的游離巰基更有利于后續(xù)的面筋聚集過程，因此縮短了面筋聚集時間，該分析也與2.2中的分析結果相一致；加入的GSH通過巰基-二硫鍵的交換反應與蛋白質結合，阻礙了蛋白質之間的進一步交聯(lián)，導致形成的面筋網絡結構穩(wěn)定性變差。

注：不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。圖4同。

2.4 GSH處理后總蛋白中二硫鍵的含量變化

從圖4可以看出，GSH處理后的面粉與蒸餾水混合后，在攪拌至面筋起始聚集時間點(LOT)時的懸浮液中蛋白質所含有的二硫鍵含量隨著GSH添加量的增加而逐漸減小。這可能是因為GSH與蛋白質間(內)二硫鍵反應，使蛋白質游離出游離巰基的同時，形成了GSSG或蛋白結合谷胱甘肽(GSSP)。也因為蛋白質間二硫鍵的破壞，其中較小的蛋白分子或蛋白亞基分子解離出來[18]，同未參與反應的GSH一起被Tris-Gly緩沖液洗脫至上清液中，使所測定的蛋白質含量有所減小，且減小量是隨著參與反應的GSH的含量的增加而增加的。在圖4中表現(xiàn)為二硫鍵含量的減少量隨著GSH添加量的增加而不斷增加，且整體減少量較游離巰基含量的增加量變化更大。

圖4 GSH處理后總蛋白中二硫鍵的含量變化

3 結論

通過面筋聚集儀分析了GSH對小麥粉面筋聚集特性的影響，隨著GSH添加量的增加，面粉峰值最大時間和聚集能逐漸減小，最大扭矩120 s后扭矩減小量逐漸增加，說明隨著GSH添加量的增加，小麥粉的面筋聚集特性發(fā)生了有規(guī)律的變化。且通過對面筋起始聚集時間點(LOT)時的懸浮液中蛋白質所含有的游離巰基和二硫鍵含量的測定，以及GSSG對小麥粉面筋聚集特性的影響的分析，結果顯示：GSSG的加入對面粉的峰值最大時間、峰值扭矩沒有顯著影響，游離巰基的含量隨GSH添加量的增加逐漸增加，而二硫鍵的含量則逐漸降低。據此認為GSH的加入是通過巰基-二硫鍵的交換反應破壞了面粉中蛋白質間(內)的二硫鍵，加速了攪拌過程中面粉中蛋白質的解聚分離過程，從而導致面筋聚集的峰值扭矩時間提前，同時也對解聚后蛋白質的重聚過程產生影響，縮短了面筋聚合時間，而且小分子GSH與蛋白質分子的結合，成為蛋白質聚合反應的終止劑，阻礙了蛋白質之間的進一步交聯(lián)，導致形成的面筋網絡結構穩(wěn)定性變弱，使面筋的聚集特性變差。