孫華迪，蔡麗麗，陳曉靜*，冉軍艦

1.河南科技學(xué)院 新科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003 2.云南商務(wù)信息工程學(xué)校，云南 昆明 650051 3.河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003

目前各類化學(xué)防腐劑的副作用逐漸被人們關(guān)注，尋找各種生物活性物質(zhì)取代化學(xué)防腐劑是食品安全領(lǐng)域亟待解決的問題。乳酸菌是應(yīng)用于多種發(fā)酵食品的安全微生物，嗜酸乳桿菌是乳酸菌的一種，屬于腸道益生菌，可以調(diào)整腸道中的菌群平衡，其分泌的細(xì)菌素對(duì)致病微生物及腐敗菌產(chǎn)生拮抗作用[1]。細(xì)菌素是一些細(xì)菌在新陳代謝過程中產(chǎn)出的一類具有活性的肽或蛋白質(zhì)[2-3]。早在20世紀(jì)20年代Gratia就發(fā)現(xiàn)V株大腸桿菌產(chǎn)生一種對(duì)Φ株大腸桿菌起拮抗作用的物質(zhì)，這類物質(zhì)被稱為大腸桿菌素[4]，但是50年后才開始在分子生物學(xué)水平上對(duì)其進(jìn)行研究。因此，隨著細(xì)菌素不斷地被發(fā)現(xiàn)，按照不同的標(biāo)準(zhǔn)將其進(jìn)行分類。按生產(chǎn)菌的種類不同可分為革蘭氏陽性菌細(xì)菌素和革蘭氏陰性菌細(xì)菌素兩類[5-6]；按照細(xì)菌素抑菌譜的大小可分為廣譜細(xì)菌素、中譜細(xì)菌素和窄譜細(xì)菌素[5]；按照細(xì)菌素分子量大小、熱穩(wěn)定性以及結(jié)構(gòu)可分為復(fù)合型大分子、羊毛硫細(xì)菌素、熱敏感大分子蛋白和小分子熱穩(wěn)定肽，可簡(jiǎn)化為是否含有羊毛硫氨酸的細(xì)菌素[7-8]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌素是一種自然產(chǎn)生的蛋白類抑菌劑，它無抗藥性，滅菌快，無殘存且成本低，生產(chǎn)快速，可對(duì)食物腐敗菌起抑制或殺滅作用[9-11]。因此，它在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥中應(yīng)用廣泛。Nisin是最早應(yīng)用于食品行業(yè)中的細(xì)菌素，可以延長(zhǎng)貨架期，并且在保質(zhì)期以內(nèi)最大程度地保持風(fēng)味不變，另外，在國(guó)外消費(fèi)較多的罐裝蔬菜中，Nisin經(jīng)常作為添加劑使用，不僅能起到改善口感的作用，也是防止罐裝蔬菜腐敗變質(zhì)的有效手段[12-13]。乳酸菌細(xì)菌素不僅可以有效地抑制動(dòng)物體內(nèi)的致病微生物的生長(zhǎng)繁殖，提高動(dòng)物的免疫力，還可以抑制養(yǎng)殖飼料中的有害微生物的增殖，所以細(xì)菌素作為抗生素的替代品添加入養(yǎng)殖飼料中也很有前景[14-15]。另外，乳酸菌細(xì)菌素的特點(diǎn)使其在食品防腐方面應(yīng)用最多[16]，而且細(xì)菌素在食品工業(yè)上的應(yīng)用也在不斷拓展，可能會(huì)作為功能性食品出現(xiàn)在人們的視野中。將細(xì)菌素與食物混合,一起被人們食用，從而進(jìn)入人體去改善腸道菌群，產(chǎn)生對(duì)人體有益的作用[17]；還有將細(xì)菌素與食品包裝袋或保鮮膜結(jié)合使用，即在食品包裝袋或保鮮膜上涂一層細(xì)菌素，可以在保藏或運(yùn)輸過程中防止食品發(fā)生腐敗變質(zhì)或微生物污染；甚至還有科學(xué)家嘗試異源表達(dá)，通過基因?qū)氲姆绞绞鼓承┚昃哂挟a(chǎn)細(xì)菌素的能力，對(duì)有害微生物起拮抗作用，從而保證食品質(zhì)量安全[18]。另外，細(xì)菌素在人類健康方面也有新的應(yīng)用。許多科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌細(xì)菌素作為一種天然的可以抑制致病菌且無抗藥性的蛋白類物質(zhì)，在口腔和皮膚護(hù)理、呼吸道感染方面有深遠(yuǎn)的潛在影響[19]。近年來，隨著對(duì)細(xì)菌素研究的深入，其功能逐漸地被認(rèn)識(shí)、了解。但細(xì)菌素在食品保藏保鮮、醫(yī)藥健康、畜牧養(yǎng)殖等方面的應(yīng)用還有很大的潛力。

本研究采用的嗜酸乳桿菌是課題組自行分離保存的一株細(xì)菌(GenBank登錄號(hào)MF804413)，該菌所產(chǎn)細(xì)菌素具有良好的抑菌活性。作者對(duì)其抑菌活性和生物穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，以期為嗜酸乳桿菌ZRX02所產(chǎn)細(xì)菌素在食品防腐、藥物治療、飼料添加等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

試驗(yàn)菌株：嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)ZRX02(GenBank: MF804413)為作者所在單位實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

指示菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門桿菌(Salmonella)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)。

1.2 主要試劑

乙酸乙酯、乳酸、乙酸：分析純；胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶：上海億欣生物科技有限公司；BHI培養(yǎng)基:北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌適用于MRS液體培養(yǎng)基。配方：檸檬酸氫二銨2 g、蛋白胨10 g、磷酸氫二鉀2 g、牛肉膏10 g、一水葡萄糖20 g、乙酸鈉5 g、酵母膏5 g、硫酸鎂0.58 g、吐溫80 1 mL、硫酸錳0.25 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至6.2～6.6，121 ℃滅菌30 min。

沙門桿菌、大腸桿菌、炭疽桿菌適用于LB液體培養(yǎng)基。配方：胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、NaCl 10 g、蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值至7.0，121 ℃滅菌30 min。在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入15 g瓊脂粉，即得LB固體培養(yǎng)基。

金黃色葡萄球菌、枯草桿菌適用于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。配方：NaCl 5 g、蛋白胨10 g、蒸餾水1 000 mL、牛肉膏3 g，調(diào)pH值至7.4～7.6，121 ℃滅菌30 min。

1.3 主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；LYNX4000冷凍離心機(jī)：泰國(guó)Thermo公司；YRE-52 A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；WFJ7200可見分光光度計(jì)：尤尼柯(上海)儀器有限公司；JA2003電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；95-2磁力攪拌器：上海司樂儀器有限公司；Model PHS-3C pH儀：上海盛磁儀器有限公司；SHP-250生化培養(yǎng)箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D(經(jīng)濟(jì)型)單人單面垂直凈化工作臺(tái)：中國(guó)蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液的制備

從-80 ℃的冰箱中拿出保藏的嗜酸乳桿菌菌種，以1%的接種量將菌種接種至50 mL的MRS液體培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱中，在恒溫37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，即為第1次活化；將第1次活化的嗜酸乳桿菌以1%接種量接種至50 mL的MRS液體培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱中，在恒溫37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，即為第2次活化；然后以同樣的步驟進(jìn)行第3次活化。將第3次活化后的嗜酸乳桿菌菌種以1%接種量接種至準(zhǔn)備好的MRS液體培養(yǎng)基，在同樣的條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)。將菌種發(fā)酵液在4 ℃下，10 000 r/min離心15 min，去沉淀留上清備用[8]。

1.4.2 抑菌試驗(yàn)

指示菌的培養(yǎng)：將實(shí)驗(yàn)室保存的指示菌菌種以1%的接種量接種到對(duì)應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，備用。

抑菌試驗(yàn)：吸取100 μL大腸桿菌均勻涂布至LB固體培養(yǎng)基上，再打直徑為6 mm的孔，將1.4.1的發(fā)酵上清液吸取100 μL加入孔內(nèi)。在37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中放置約8 h后拿出，測(cè)量出現(xiàn)的抑菌圈直徑[20]。

1.4.3 抑菌物質(zhì)的初步鑒定

排除發(fā)酵液中有機(jī)酸的作用：取嗜酸乳桿菌發(fā)酵上清液，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)酸堿度，直至pH值為5.0。同時(shí)用乳酸、乙酸調(diào)節(jié)空白培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)至pH值為5.0作為空白對(duì)照，按1.4.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

排除發(fā)酵液中過氧化氫的作用：取細(xì)菌發(fā)酵上清液，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl溶液調(diào)pH值至7.0，再加入過氧化氫酶使其終質(zhì)量濃度達(dá)到5 g/L，37 ℃水浴中放置2 h后取出，再將pH值調(diào)回5.0。通過牛津杯法[21]測(cè)試其抑菌效果。

1.4.4 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的粗提取

在前期研究的基礎(chǔ)上[22]，通過乙酸乙酯萃取的方法粗提取嗜酸乳桿菌細(xì)菌素。將發(fā)酵上清液以1∶1的體積比與乙酸乙酯混合進(jìn)行萃取，萃取時(shí)間為1 h，萃取2次，棄掉下層溶液保留上層溶液，且將上層的有機(jī)相進(jìn)行旋蒸。旋蒸產(chǎn)物用pH=7.0的PBS復(fù)溶，復(fù)溶比例為100∶1(即1 000 mL的細(xì)菌發(fā)酵液用10 mL的PBS復(fù)溶液復(fù)溶)。

1.4.5 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌譜測(cè)定

將培養(yǎng)好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門桿菌、鼠李糖乳桿菌、炭疽桿菌、李斯特氏菌、枯草桿菌、植物乳桿菌、無乳鏈球菌、嗜酸乳桿菌分別吸取100 μL均勻涂布至對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，在涂布好的固體培養(yǎng)基上打直徑為6 mm的孔，將粗提的細(xì)菌素吸取100 μL接入打好的孔中。放入37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)約8 h取出，測(cè)量出現(xiàn)的抑菌圈直徑。

1.4.6 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素穩(wěn)定性的測(cè)定

1.4.6.1 熱穩(wěn)定性測(cè)定

將粗提取的嗜酸乳桿菌細(xì)菌素分別置于8個(gè)離心管中，將離心管分別在-80 ℃、-20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃、121 ℃條件下處理30 min，室溫條件下放置30 min作為對(duì)照。待所有離心管處理完拿出冷卻后，將損失的細(xì)菌素用雙蒸水補(bǔ)回[22]。按1.4.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.4.6.2 酸堿穩(wěn)定性測(cè)定

將通過乙酸乙酯萃取法粗提取的細(xì)菌素分別置于8個(gè)離心管中，將離心管中的細(xì)菌素分別調(diào)pH值至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在室溫下放置24 h，再調(diào)回原來的pH值(pH=2.0)，以pH 2.0的作為對(duì)照。按1.4.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[23]。

1.4.6.3 蛋白酶的敏感性測(cè)定

稱取胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶以及堿性蛋白酶分別加入粗提細(xì)菌素中，使終質(zhì)量濃度達(dá)到1 g/L，混勻，用1 mol/L的NaOH和1 mol/L的HCl將每個(gè)細(xì)菌素的pH值調(diào)節(jié)至對(duì)應(yīng)放入酶的最適pH值。在37 ℃條件下處理1 h，室溫下放置24 h，待反應(yīng)結(jié)束后，將pH值調(diào)回原始值。以未經(jīng)酶處理的細(xì)菌素作為對(duì)照，按1.4.2進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌物質(zhì)的初步鑒定

嗜酸乳桿菌發(fā)酵后可以產(chǎn)生多種物質(zhì)，如有機(jī)酸、過氧化氫等物質(zhì)[24]，因此，抑菌物質(zhì)的初步鑒定也就是排除有機(jī)酸以及過氧化氫對(duì)抑菌效果的影響。經(jīng)過過氧化氫酶處理的發(fā)酵上清液比未經(jīng)酶處理的發(fā)酵上清液抑菌效果較差，說明嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌效果不是過氧化氫的作用。經(jīng)過乳酸、乙酸分別調(diào)節(jié)pH值為5.0的MRS培養(yǎng)基幾乎沒有抑菌效果。說明可以排除有機(jī)酸對(duì)抑菌作用的影響。

2.2 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌譜

由表1可知，嗜酸乳桿菌細(xì)菌素可以有效地抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門桿菌、炭疽桿菌、李斯特氏菌、枯草桿菌以及無乳鏈球菌，抑菌圈均達(dá)到30 mm以上，屬于廣譜細(xì)菌素。這也說明可以用嗜酸乳桿菌細(xì)菌素來抑制食源性致病菌及腐敗菌，且抑菌效果良好。

表 1 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌譜

2.3 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的穩(wěn)定性

2.3.1 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性

嗜酸乳桿菌細(xì)菌素?zé)岱€(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖1所示。隨著溫度升高抑菌活性逐漸降低，在經(jīng)過121 ℃處理30 min后，該細(xì)菌素依然保留90%的抑菌效果，說明嗜酸乳桿菌細(xì)菌素?zé)岱€(wěn)定性良好。在經(jīng)過-80 ℃、-20 ℃處理后，抑菌效果比室溫對(duì)照的抑菌效果好，因此，低溫保藏或超低溫凍藏細(xì)菌素可以保持活性。

圖1 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的熱穩(wěn)定性

2.3.2 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的pH值穩(wěn)定性

嗜酸乳桿菌細(xì)菌素pH值穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如圖2所示。隨pH值的升高，嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的抑菌活性逐漸降低。在pH 2.0時(shí)，抑菌活性最強(qiáng)，在pH 9.0時(shí)仍保留64%的抑菌活性。說明該細(xì)菌素對(duì)酸堿都有很好的穩(wěn)定性。

圖2 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的pH值穩(wěn)定性

2.3.3 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的蛋白酶敏感性

嗜酸乳桿菌細(xì)菌素對(duì)蛋白酶的敏感性試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。在經(jīng)過胰蛋白酶、蛋白酶K、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶以及中性蛋白酶處理后，細(xì)菌素抑菌活性分別保留73%、62%、79%、75%、73%，而經(jīng)過胃蛋白酶處理后變化不明顯。嗜酸乳桿菌細(xì)菌素對(duì)中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶較為敏感，對(duì)蛋白酶K最敏感，說明該細(xì)菌素是蛋白類物質(zhì)。

圖3 嗜酸乳桿菌細(xì)菌素的蛋白酶敏感性

3 結(jié)論

本試驗(yàn)排除有機(jī)酸及過氧化氫的影響，發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)是蛋白類物質(zhì)。通過乙酸乙酯萃取法粗提的細(xì)菌素為廣譜細(xì)菌素，可以有效抑制一些革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、炭疽桿菌、無乳鏈球菌、枯草桿菌以及李斯特氏菌。嗜酸乳桿菌細(xì)菌素不僅具有良好的抑菌效果，而且具有良好的熱穩(wěn)定性、pH值穩(wěn)定性，且對(duì)蛋白酶敏感。該細(xì)菌素經(jīng)過121 ℃處理30 min后，仍保存90%的抑菌效果；在pH=2.0時(shí)抑菌圈直徑達(dá)到32 mm，堿性條件下(pH=9.0)保留64%的抑菌活性。當(dāng)嗜酸乳桿菌細(xì)菌素經(jīng)過胰蛋白酶、蛋白酶K處理后，抑菌活性仍分別保留73%、62%，在經(jīng)過其他蛋白酶處理后都有不同程度的下降。這一系列的試驗(yàn)結(jié)果說明：嗜酸乳桿菌細(xì)菌素具有良好的抑菌效果、熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，且對(duì)蛋白酶敏感。這些特點(diǎn)都有利于該細(xì)菌素在食品、醫(yī)藥等工業(yè)上的應(yīng)用。