武立清，孫 玲，黃麗麗，顏 霞

(1.西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100；2.西北農林科技大學，旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100; 3.西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌 712100)

據統計，目前所發(fā)現的抗生素約2/3直接或間接來源于微生物，其中鏈霉菌是主要的生物活性物質生產者[1-2]。鏈霉菌是一類好氧、高GC含量的革蘭氏陽性菌，能夠產生種類繁多的次級代謝產物，在醫(yī)藥、農業(yè)以及畜牧業(yè)中體現出重要的應用價值。

楊凌鏈霉菌KM-1-2是從銀杏種子中分離到的鏈霉菌(Streptomyces)新種[3]。全基因組測序結果表明，KM-1-2基因組大小約為5.78 Mb，GC含量達72.8%，預測得到5 299個編碼基因，占基因組全長的88.67%。根據antiSMASH在線分析結果，KM-1-2基因組共有21個次級代謝產物生物合成基因簇，包括非核糖體多肽合成酶(Non-ribosomal Peptide Synthetase, NRPS)、聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS)、萜烯類(Terpene)、鐵載體(Siderophore)及四氫嘧啶(Ectoine)等多種類型。其中NRPS型基因簇Cluster 4上存在1個SARP家族轉錄調控因子km790，SARP家族轉錄調控因子包括1個保守的DNA結合結構域(DNA-binding domain, DBD)和1個毗鄰的細菌轉錄激活結構域(bacterial transcriptional activation domain, BTAD)，通常被認為在抗生素合成途徑中發(fā)揮正調控的作用[4-7]。在鏈霉菌抗生素合成的過程中，SARPs通過招募RNA聚合酶(RNA polymerase，RNAP)到目的基因的啟動子上形成1個DNA-SARP-RNAP激活轉錄復合物[8]，從而促進目標抗生素的合成。為了進一步研究菌株KM-1-2的次級代謝產物生物合成基因簇，必須先建立簡單高效的遺傳轉化體系。

鏈霉菌中外源質?；蚧驅氲姆椒ㄖ饕邪≒EG介導的原生質體法、接合轉移法和電轉化法[9-11]。原生質體法是一種常規(guī)的基因轉移方法，但由于很多鏈霉菌都具有限制修飾系統[12]，所以外源遺傳物質難以轉化進入，而接合轉移操作簡便，能夠避開胞外核酸酶，在一定程度上可以克服鏈霉菌對外源遺傳物質的限制[13]。Mazodier等[14]于1989年首次建立大腸桿菌-鏈霉菌的接合轉移法；而后隨著大量穿梭質粒成功的構建[15]，接合轉移法作為一種高效的基因轉移法被廣泛用于鏈霉菌遺傳轉化體系的建立。如：Azalomycin F產生菌—鏈霉菌21172613(Streptomycessp. 21172613)[16]、Toyocamycin產生菌—淀粉產色鏈霉菌1628(Streptomycesdiastatochromogenes1628)[17]、Xinaomycins產生菌—諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)[18]以及谷氨酰胺轉氨酶產生菌(Streptomycesmobaraensis)[19]接合轉移體系的構建。

本研究首次通過接合轉移的方法將外源質粒導入楊凌鏈霉菌KM-1-2中，建立并優(yōu)化該菌的遺傳轉化體系，同時過表達SARP家族轉錄調控因子km790，并檢測過表達菌株的生長狀態(tài)及對病原真菌的拮抗性，為后續(xù)研究KM-1-2的次級代謝產物的合成及其調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質粒菌株 鏈霉菌(Streptomycesyanglingensis)KM-1-2、大腸桿菌(Escherichiacoli)S17-1、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、蘋果腐爛病菌(Valsamali)03-8、黃瓜灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)及葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)均來自西北農林科技大學果樹病害研究室。

質粒：pSET152為大腸桿菌-鏈霉菌穿梭整合型質粒，具有安普霉素抗性基因acc(3)Ⅳ、接合轉移起點OriT、pUC18復制子、噬菌體φC31整合酶(int)基因和attP整合位點[15]；pSET152-ermEp*為帶有紅霉素抗性基因啟動子的過表達型質粒，由西北農林科技大學生命科學學院賈良輝老師饋贈；pKC1139為溫敏穿梭型質粒，具有安普霉素抗性基因acc(3)Ⅳ，在溫度高于39 ℃時不能自主復制，常用于鏈霉菌的基因敲除[15]。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基 鏈霉菌KM-1-2產孢培養(yǎng)基為黃豆粉培養(yǎng)基；孢子預萌發(fā)培養(yǎng)基為2×YT；接合轉移培養(yǎng)基分別采用高氏Ⅰ號、MS、2CMY及黃豆粉培養(yǎng)基；液體培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)；發(fā)酵培養(yǎng)基為SPY，具體配方參見鏈霉菌遺傳操作手冊[20]；大腸桿菌培養(yǎng)基為LB；病原真菌采用PDA培養(yǎng)基。

抗生素：安普霉素(Apramycin)、卡那霉素(Kanamycin)、紅霉素(Erythromycin)、潮霉素(Hygromycin)、萘啶酮酸(Nalidixicacid)均購自上海生工。

1.2 方 法

1.2.1 質粒及鏈霉菌基因組提取 大腸桿菌質粒提取及轉化參照分子生物學指南[21]，鏈霉菌基因組DNA和質粒的提取參照鏈霉菌遺傳操作手冊[20]。

1.2.2 抗生素耐受性測定 分別配制含安普霉素、卡那霉素、紅霉素、潮霉素以及萘啶酮酸不同質量濃度梯度(0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0、50.0 mg/L)的黃豆粉培養(yǎng)基平板，劃線接種鏈霉菌KM-1-2，28 ℃培養(yǎng)6 d后觀察菌株的生長 情況。

1.2.3 接合轉移 將整合型質粒pSET152通過熱激法轉入大腸桿菌S17-1中，得到供體菌大腸桿菌S17-1/pSET152。挑取單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基(含Apr 50 mg/L)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～14 h后按體積比1∶100轉接于LB液體培養(yǎng)基(含Apr 50 mg/L)中。37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6時離心收集菌體，用等體積不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基洗滌菌體3次，最后將菌體懸浮于0.5 mL的LB培養(yǎng)基中。同時，刮取生長7 d的KM-1-2孢子，放入10 mL蒸餾水中渦旋振蕩并過濾，2 739 g離心10 min收集孢子，并懸浮于0.5 mL的2×YT培養(yǎng)基中。45～55 ℃熱激10 min后于28 ℃、180 r/min預萌發(fā)2～3 h。將備用的大腸桿菌S17-1和預萌發(fā)好的KM-1-2孢子懸液按體積比為1∶1的比例混合，涂布于接合轉移培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng) 16～20 h后覆蓋萘啶酮酸(質量濃度25 mg/L)和安普霉素(質量濃度3 mg/L)，然后于28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至長出接合子。本試驗中供體菌大腸桿菌S17-1的數量密度保持為108CFU/mL，受體菌KM-1-2孢子數密度為107～109CFU/mL，最后以肉眼可分辨的轉化子為準。接合效率=接合子數/孢子量，取3次重復的平均值。

溫敏型穿梭質粒pKC1139的接合轉移方法同上。

1.2.4 接合子的PCR驗證 將接合子轉接在含有安普霉素(Apr 3 mg/L)的黃豆粉培養(yǎng)基上，挑取單克隆接種于TSB培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。

pSET152型接合子的驗證需提取鏈霉菌基因組DNA作為模板。根據安普霉素抗性基因設計驗證引物，以鏈霉菌KM-1-2基因組DNA為陰性對照，質粒pSET152為陽性對照，擴增Apr抗性基因，片段大小為750 bp。PCR反應體系： 5 μL的2×TaqMasterMix，10 μmol/L的正反引物各1 μL，1 μL的DNA模板，1 μL的DMSO，ddH2O補至10 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。引物由上海生工合成，序列如下：AMF，5′-GGTTCATGTGCAGCTCCATCAGC-3′；AMR，5′-ATGAGCTCAGCCAATC- GACTGG-3′。

pKC1139型接合子的驗證需提取鏈霉菌質粒作為模板。根據pKC1139載體上的序列設計驗證引物，以鏈霉菌KM-1-2的質粒為陰性對照，質粒pKC1139為陽性對照，擴增片段大小為898 bp。PCR反應體系：5 μL的2×TaqMasterMix，10 μmol/L的正反引物各1 μL，1 μL的DNA模板，1 μL的DMSO，ddH2O補至10 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，34個循環(huán)；72 ℃ 2 min。引物由上海生工合成，序列如下：pKCF，5′-AAGGCGATTAAGTTGGGTA-3′；pKCR，5′-GTGGCGATAAGTCGTGTCT-3′。

1.2.5 過表達菌株Skm790的構建 根據鏈霉菌KM-1-2中km790基因序列設計引物，并在引物5′端引入pSET152-ermEp*載體雙酶切末端同源序列及酶切位點，引物序列如下：km790F，5′-TCGTGCCGGTTGGTAGGATCCCCACAGGAGGACGTGACATGGAGTTCCGGATACT-CGGCCCG-3′；km790R，5′-AGCTTGGGCTGCAGGTCGACTCTAGATCAGCCGGCCGCCG-CCAC-3′，由上海生工合成。模板為鏈霉菌KM-1-2基因組DNA，PCR反應體系：25 μL的2×Phanta Max Buffer，1 μL的10 mmol/L dNTP Mix，10 μmol/L的正反引物各2 μL，1 μL基因組DNA模板，1 μL 的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，ddH2O補至50 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。

PCR擴增產物由1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后與經BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切后的pSET152-ermEp*載體回收產物通過一步克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit)(Vazyme)進行連接，獲得的重組質粒轉入大腸桿菌DH5α。挑取單克隆提取質粒，PCR檢測后測序驗證，得到陽性重組質粒pSkm790。將重組質粒pSkm790轉入大腸桿菌S17-1中，與野生型鏈霉菌KM-1-2進行接合轉移獲得接合子。提取基因組DNA，用Apr抗性引物AMF/AMR進行PCR驗證，以野生型鏈霉菌KM-1-2為陰性對照，質粒pSkm790為陽性對照。

1.2.6 過表達菌株Skm790表型及活性檢測 挑取野生型菌株KM-1-2與過表達菌株Skm790的單菌落分別接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min進行培養(yǎng)，每隔24 h取5 mL菌液，重復3次。烘干后測量菌絲體干質量，以培養(yǎng)時間為橫坐標，菌絲體干質量為縱坐標繪制生長曲線。此外，將鏈霉菌KM-1-2和Skm790分別接種于黃豆粉培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察二者的產孢情況。

采用皿內對峙的方法，檢測野生型菌株KM-1-2與過表達菌株Skm790對病原真菌的拮抗性。將病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng) 3 d，鏈霉菌KM-1-2和Skm790分別接種于黃豆粉培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d，用打孔器分別打取菌餅。然后將病原真菌的菌餅放置在PDA平板中央，距病原真菌菌餅2.5 cm處對稱接種野生型菌株KM-1-2和過表達菌株Skm790，25 ℃培養(yǎng)并觀察拮抗效果。

1.2.7 菌株發(fā)酵及代謝產物分析 將生長7 d的野生型菌株KM-1-2和過表達菌株Skm790分別接種于TSB種子培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。按體積比為1∶10的比例將種子培養(yǎng)液轉接于SPY發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液用乙酸乙酯按體積比為1∶1的比例萃取3次，收集上層有機相旋蒸濃縮，濃縮后的產物用1 mL甲醇溶解后用于后續(xù)HPLC分析。

HPLC分析條件：利用C18反向層析柱，采取梯度洗脫的方法，流動相為水(A)和甲醇(B)。整個洗脫過程如下：0～5 min，10% B；5～35 min，10%～100% B；35～45 min，100% B；45～50 min，100%～10% B；柱溫25 ℃，進樣量10 μL，流速1 mL/min，檢測波長210 nm。

2 結果與分析

2.1 KM-1-2遺傳轉化體系的建立和優(yōu)化

2.1.1 KM-1-2的抗生素耐受性 鏈霉菌KM-1-2的抗生素耐受性檢測結果如表1所示，其對安普霉素和卡那霉素比較敏感，在Apr 1 mg/L、Kan 5 mg/L的培養(yǎng)基上生長極慢，在Apr 2 mg/L、Kan 10 mg/L時不能生長，對紅霉素、潮霉素和萘啶酮酸不敏感，在質量濃度為25 mg/L時仍可生長。因此，接合轉移中可用安普霉素或卡那霉素作為抗性篩選標記，用于篩選接合子，用25 mg/L的萘啶酮酸抑制供體菌大腸桿菌的 生長。

表1 KM-1-2對不同抗生素的敏感性Table 1 Sensitivity of KM-1-2 to antibiotics

2.1.2 接合轉移培養(yǎng)基的選擇 選取高氏Ⅰ號、MS、2CMY及黃豆粉培養(yǎng)基作為接合轉移培養(yǎng)基，結果如表2所示，高氏Ⅰ號和MS培養(yǎng)基上均未長出接合子。黃豆粉培養(yǎng)基上接合子長勢良好，但大腸桿菌生長速率較快，二者混合生長，難以挑出單菌落。而2CMY培養(yǎng)基上接合子數量多且大腸桿菌生長速率較慢，因此選擇2CMY作為接合轉移最適培養(yǎng)基。

表2 KM-1-2接合轉移培養(yǎng)基的選擇Table 2 Selection of KM-1-2 conjugation transfer medium

2.1.3 熱激溫度對接合轉移效率的影響 選取45、50、55 ℃ 3個熱激溫度，分別處理10 min，然后于28 ℃、180 r/min預萌發(fā)2.5 h。結果如表3所示，在50 ℃，熱激10 min的條件下，接合轉移效率最高，達1.052×10-5。溫度為45 ℃時，接合效率為5.16×10-6，而當熱激溫度為55 ℃時，沒有接合子出現。因此，50 ℃熱激10 min后，于28 ℃、180 r/min預萌發(fā)2.5 h為孢子預萌發(fā)的最適條件。

2.1.4 接合轉移時間對接合轉移效率的影響 選取17～18、18～19、19～20 h 3個時間段覆蓋抗生素，其中萘啶酮酸的質量濃度為25 mg/L，安普霉素的質量濃度為3 mg/L。結果如表4所示，在17～18 h覆蓋抗生素時，接合子較少。在18～19 h覆蓋抗生素，接合轉移效率最高，達到 1.052×10-5。而在19 h后再覆蓋抗生素則得不到接合子。因此，18～19 h，Nal 25 mg/L，Apr 3 mg/L為鏈霉菌KM-1-2抗生素覆蓋的最佳 條件。

表3 不同熱激溫度下KM-1-2接合轉移效率Table 3 Conjugation frequency of KM-1-2 at differentheat shock temperatures

表4 不同接合轉移時間下KM-1-2接合轉移效率Table 4 Conjugation frequency of KM-1-2at differentconjugation transfer times

2.1.5 接合子的PCR鑒定及穩(wěn)定性檢測 pSET152是基因整合型質粒，在轉入鏈霉菌KM-1-2后，整合在該菌株的基因組上。隨機挑取接合子，參照CTAB法提取基因組DNA，利用安普霉素抗性基因引物AMF/AMR進行PCR鑒定。結果表明，陽性對照pSET152和接合轉化子均可以擴增出750 bp的Apr基因片段，而野生型鏈霉菌KM-1-2未擴增出目的片段，由此證明質粒pSET152成功整合在鏈霉菌KM-1-2的基因 組上。

pKC1139質粒轉入鏈霉菌KM-1-2后，采用堿裂解法提取質粒，利用質粒上的序列引物pKCF/pKCR進行PCR鑒定。結果表明，陽性對照pKC1139和接合轉化子均擴增出898 bp的目的片段，而野生型鏈霉菌KM-1-2未能擴增出該片段，由此證明質粒pKC1139成功轉入鏈霉菌KM-1-2中。

為了檢測質粒在接合子中的遺傳穩(wěn)定性，將驗證正確后的接合子在含有安普霉素和不含安普霉素的兩類平板上進行抗性交替?zhèn)鞔?，傳?0次后接種于TSB培養(yǎng)基中(Apr 3mg/L，Nal 25 mg/L)培養(yǎng)，結果顯示接合子均可以正常生長。提取基因組DNA或質粒經PCR鑒定后，與之前的驗證結果一致。表明質粒pSET152/pKC1139均可以在KM-1-2中穩(wěn)定遺傳。

2.2 基因 km790的過表達

2.2.1 基因km790的生物信息學 通過antiSMASH分析鏈霉菌KM-1-2的全基因組，序列分析表明Cluster 4預測為NRPS型基因簇，該基因簇上存在1個SARP家族轉錄調控因子km790?；騥m790編碼1個含835個氨基酸的SARP家族蛋白，結果如圖1所示。該蛋白存在1個結合DNA的特征性結構—螺旋-轉角-螺旋(Helix-turn-helix, HTH)和一個細菌轉錄激活結構域(Bacterial Transcriptional Activation domain, BTA)，二者共同作用促進基因簇的表達。

圖1 km790編碼蛋白的功能結構域預測Fig.1 Functional domain prediction of km790 encoded protein

2.2.2 過表達菌株Skm790的構建 通過接合轉移篩選過表達菌株Skm790，提取基因組DNA，利用Apr抗性基因引物AMF/AMR進行鑒定。結果如圖2所示，陽性對照pSkm790和過表達接合子Skm790均能擴增出750 bp的目的片段，而野生型鏈霉菌KM-1-2未能擴增出該片段，表明菌株Skm790過表達成功。

W. 野生型鏈霉菌KM-1-2；M. DNA Maker；P. 質粒pSkm790；S. Skm790接合子

2.2.3 過表達菌株Skm790的表型及活性分析 野生型菌株KM-1-2和過表達菌株Skm790的生長曲線如圖3所示。0～24 h處于菌體生長的遲緩期，24 h后菌體生長迅速，進入對數生長期，于96 h時生長量達到最大值，而當培養(yǎng)至120 h時，菌體生長變緩，甚至有衰亡的趨勢。從兩株菌的生長曲線可以看出，與野生型菌株KM-1-2相比，過表達菌株Skm790生長速率加快，菌體量 增加。

將野生型鏈霉菌KM-1-2和過表達菌株Skm790同時劃線接種于黃豆粉培養(yǎng)基上，在 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察野生型菌株和過表達菌株的生長及形態(tài)分化，結果如圖4所示。在 28 ℃培養(yǎng)4 d時，野生型鏈霉菌KM-1-2在黃豆粉平板及光學顯微鏡下可觀察到白色的氣生菌絲，而過表達菌株Skm790在產生氣生菌絲的同時可觀察到孢子鏈和孢子的產生。表明km790的過表達可以促進孢子分化，使菌株的產孢時間提前。

鏈霉菌KM-1-2和過表達菌株Skm790對病原真菌的拮抗效果如圖5所示。結果表明，Skm790對病原真菌蘋果腐爛病菌、黃瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌以及葡萄灰霉病菌的抑菌圈均大于KM-1-2，抑制效果明顯強于野生型 KM-1-2。

圖3 鏈霉菌KM-1-2和Skm790的生長曲線Fig.3 Growth curve of KM-1-2 and Skm790

2.2.4 次級代謝產物分析 檢測波長為210 nm時，野生型鏈霉菌KM-1-2和過表達菌株Skm790的HPLC分析結果如圖6所示。結果顯示，在出峰時間為27.15和31.18 min左右時，Skm790對應的吸收峰顯著增強，命名為X和Y。二者的紫外掃描結果見圖7，結果顯示，X對應的物質在(225±1) nm和(277±1) nm處有典型吸收峰，而Y對應的物質在(218±1) nm和(278±1) nm處存在典型吸收峰。HPLC結果表明，基因km790對X和Y對應物質的合成起正調控作用，而本研究表明過表達菌株Skm790對病原真菌的拮抗性顯著大于野生型鏈霉菌KM-1-2，推測X或Y對應的物質可能與菌株的拮抗性相關。

鏈霉菌KM-1-2在黃豆粉平板上的生長狀態(tài)(A)及在光學顯微鏡下的形態(tài)觀察(C)；過表達菌株Skm790在黃豆粉平板上的生長狀態(tài)(B)及在光學顯微鏡下的形態(tài)觀察(D)

病原真菌從左向右依次為蘋果腐爛病菌、黃瓜灰霉病菌、番茄灰霉病菌、葡萄灰霉病菌；左側菌餅為野生型鏈霉菌KM-1-2，右側菌餅為過表達菌株Skm790

藍色曲線代表野生型鏈霉菌KM-1-2，黑色曲線代表過表達菌株Skm790

圖7 X(A)和Y(B)的紫外光譜Fig.7 UV spectrum of X(A) and Y(B)

3 討 論

本研究以楊凌鏈霉菌KM-1-2為出發(fā)菌株，通過接合轉移的方法建立其遺傳轉化體系。由于鏈霉菌是一個高度分化的菌屬，不同菌種之間差異很大，適用于一種鏈霉菌的轉化方法不一定適用于其他鏈霉菌[22-23]，而且由于遺傳背景的不同，即使同一種鏈霉菌的不同菌株，轉化效率也存在很大差別[24]。因此，本試驗在鏈霉菌KM-1-2抗生素耐受性檢測、熱激溫度、接合轉移培養(yǎng)基以及接合轉移時間等選擇的基礎上，探索該菌株的最佳轉化條件。

鏈霉菌KM-1-2在黃豆粉培養(yǎng)基上生長迅速且產孢量豐富，所以以黃豆粉培養(yǎng)基作為該菌最適產孢培養(yǎng)基。在接合轉移時，大腸桿菌在黃豆粉培養(yǎng)基上生長速度較快，得到的轉化子易被污染，而在2CMY培養(yǎng)基上接合子數量多且大腸桿菌生長速度緩慢，因此選擇2CMY作為最適接合轉移培養(yǎng)基。研究表明，適當的熱激處理可降低細胞內限制酶的活性[25-26]，提高接合轉移效率，隨著熱激溫度的升高，接合轉移效率也隨之升高，但溫度達到55 ℃時，孢子會喪失活性，因此確定最適熱激溫度為50 ℃。此外，抗生素覆蓋時間對接合轉移效率也有顯著影響，時間少于17 h，接合轉移不完全，覆蓋抗生素時極易刮斷基內菌絲，而時間長于19 h，大腸桿菌大量生長覆蓋培養(yǎng)基，難以挑出轉化子。綜合以上因素，適合楊凌鏈霉菌KM-1-2的遺傳轉化體系為：以2CMY為最適接合轉移培養(yǎng)基，孢子于50 ℃熱激10 min，抗生素覆蓋時間介于18～19 h，其中萘啶酮酸質量濃度為25 mg/L，安普霉素為3 mg/L，此時接合轉移效率最高，達1.052×10-5。

SARPs編碼基因是不同鏈霉菌中一種重要的次級代謝產物調控基因，在trioxacarcin、indigoidine、pristinamycin、tacrolimus和chromomycins等的合成中，SARPs作為激活子促進這些次級代謝產物的生物合成[27-31]。本試驗利用該轉化體系，成功將KM-1-2基因組中SARP家族轉錄調控因子km790過表達，獲得的過表達菌株Skm790生長速率加快，孢子產生時間提前，通過對部分病原真菌的拮抗性檢測，發(fā)現其抗病性增強。代謝圖譜檢測分析結果表明，與野生型鏈霉菌KM-1-2相比，過表達菌株Skm790在保留時間為27.15和31.18 min左右時對應的吸收峰顯著增強。推測該吸收峰對應的物質可能與菌株的拮抗性有關，但其確切的功能還需對菌株進行大量發(fā)酵，并對該物質分離純化進行鑒定，從而進一步研究其抗病機制。

楊凌鏈霉菌KM-1-2遺傳轉化體系的建立及優(yōu)化是對次級代謝產物基因簇進行研究的必要前提，為進一步對菌株資源的開發(fā)利用奠定基礎。