祝景偉，佟經(jīng)偉，許培權(quán)

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(蚌埠 233004)

Hippo信號通路是近年來首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的一條高度保守的抑制性信號通路，通過抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡來調(diào)節(jié)器官的發(fā)育[1]。越來越多的研究表明，該信號通路的異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2-6]。具有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共活化蛋白(Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)和Yes相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)是Hippo信號通路的兩個核心下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子，在多種腫瘤中存在過表達(dá)現(xiàn)象[2-3，7-9]。三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受體(Estrogen receptors,ER)、孕激素受體(Progesterone receptors,PR)和人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)均為陰性的乳腺癌。TNBC惡性程度高、侵襲性強(qiáng)、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、預(yù)后差、對內(nèi)分泌及靶向治療反應(yīng)不敏感，目前化療仍為TNBC患者主要的全身治療手段。大部分接受化療的患者面臨著毒性難以耐受與治療后疾病進(jìn)展的難題，而且轉(zhuǎn)移性乳腺癌在經(jīng)過幾線治療后，化療的有效率愈發(fā)低下。因此，尋找有效的靶向治療分子，對TNBC的早期診斷及治療至關(guān)重要。本研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測TAZ、YAP蛋白在TNBC組織中的表達(dá)，探討TAZ、YAP蛋白與TNBC患者的臨床病理特征的關(guān)系，為TNBC的靶向治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 收集2013年11月至2014年12月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤外科收治的TNBC患者30例為研究組，取同期非三陰性乳腺癌(Non-triplenegative breast cancer,non-TNBC)患者30例做對照組。所有患者均為女性，年齡28～72歲，中位年齡47歲。腫瘤體積大小≤2 cm 30例，2～5 cm 26例，>5 cm 4例。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。TNM分期：I期15例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例。組織學(xué)分級：Ⅰ-Ⅱ級38例，Ⅲ級22例。所有患者術(shù)前均未接受過放療、化療、靶向及內(nèi)分泌治療，入院后經(jīng)我院病理科確診為浸潤性乳腺癌后行乳腺癌改良根治術(shù)。兩組患者臨床病理資料對比見表1。

表1 兩組一般資料對比(例)

2 TAZ和YAP檢測 兔抗人TAZ抗體和重組YAP抗體購自美國Abcam公司(ab110239)。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，采用免疫組織化學(xué)標(biāo)記(SP法)進(jìn)行檢測。石蠟標(biāo)本常規(guī)切片后脫蠟、水化、蒸餾水沖洗，用PBS(pH值=7.4)沖洗3次，每次3 min。高溫高壓對組織抗原進(jìn)行修復(fù)，冷卻至室溫，PBS緩沖液浸泡5 min，重復(fù)3次。3%過氧化氫室溫下孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次3 min。甩去PBS，滴加第一抗體(TAZ抗體/YAP抗體)，4 ℃過夜。PBS沖洗3次，每次3 min，甩去PBS，滴加二抗(根據(jù)Abcam公司二抗試劑盒說明書進(jìn)行操作)，PBS沖洗3次，每次3 min。甩去PBS，滴加DAB顯色液，蒸餾水沖洗，進(jìn)行復(fù)染、脫水、透明、自然干燥后封片。

3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 本實驗中病理檢測結(jié)果的判斷由我院病理科兩名高年資副主任醫(yī)師擔(dān)任。TAZ和YAP蛋白表達(dá)在細(xì)胞核和(或)胞質(zhì)中，并呈棕黃色顆粒為陽性。隨機(jī)選取5個高倍鏡(200倍)視野，根據(jù)細(xì)胞著色比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行評價。細(xì)胞著色比例：<10%記為0分，10%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分；染色強(qiáng)度：無著色記為0分，淡黃色記為1分，黃色記為2分，棕黃色記為3分。上述兩項結(jié)果相乘，得分<3為陰性，≥3為陽性。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TAZ在三陰性乳腺癌組織和非三陰性乳腺癌組織中的表達(dá) 30例研究組癌組織中，TAZ陽性率為56.7%，30例對照組癌組織中TAZ陽性率為16.7%。研究組癌組織中TAZ陽性率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

A：TAZ在研究組中的陽性表達(dá)；B：TAZ在研究組中的陰性表達(dá)；C：TAZ在對照組中的陽性表達(dá)；D：TAZ在對照組中的陰性表達(dá)

表2 兩組癌組織中TAZ的表達(dá)

2 YAP在三陰性乳腺癌組織和非三陰性乳腺癌組織中的表達(dá) 30例研究組癌組織中，YAP陽性率為73.3%，30例對照組癌組織中YAP陽性率為43.3%。研究組癌組織中YAP陽性率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 兩組癌組織中YAP的表達(dá)

A：YAP在研究組中的陽性表達(dá)；B：YAP在研究組中的陰性表達(dá)；C：YAP在對照組中的陽性表達(dá)；D：YAP在對照組中的陰性表達(dá)

3 TAZ和YAP在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 TAZ和YAP的陽性表達(dá)均與腫瘤大小和組織學(xué)分級有關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而與發(fā)病年齡、臨床病理分期、淋巴及轉(zhuǎn)移情況無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>021:00 2020-9-9.05)。見表4。

表4 研究組中TAZ和YAP的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

4 TAZ和YAP在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 在研究組中，TAZ和YAP共同陽性表達(dá)的有16例，共同陰性表達(dá)的有7例。根據(jù)Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，TAZ和YAP蛋白在研究組中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.537,P<0.05)。

討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、臨床表現(xiàn)以及治療反應(yīng)性上具有高度異質(zhì)性。TNBC作為乳腺癌的一種亞型，占所有乳腺癌的15%～20%[10]，具有與其他乳腺癌亞型不同的臨床病理特征。常表現(xiàn)為：發(fā)病年齡較輕、腫瘤直徑大、組織學(xué)分級高、腋窩淋巴結(jié)常陰性、易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、生存時間短等特點[11]，目前尚無標(biāo)準(zhǔn)的治療方案。本組資料顯示，發(fā)病年齡最輕(28歲)的發(fā)生在研究組，且年齡≤45歲的患者多于對照組；腫瘤直徑常>2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率不高，與以上報道基本一致。

Hippo信號通路在進(jìn)化上是一條高度保守的抑制性信號通路。1995年，兩個實驗室在果蠅中運用遺傳學(xué)篩選尋找腫瘤抑制基因時幾乎同時發(fā)現(xiàn)了第一個Hippo信號通路成員Wts[12-13]，其主要負(fù)責(zé)編碼NDR(Nuclear Dbf2-related)家族蛋白激酶，Wts突變導(dǎo)致組織過度生長。此后研究發(fā)現(xiàn)了Hippo信號通路的其他核心成員，包括Sav(Salvador)、Hpo(Hippo)、Mats(Mob as tumer suppressor)、Yki(Yorkie)。Hippo信號通路的核心成員在哺乳動物中都有相對應(yīng)的同源蛋白分子，Hpo、Sav、Mats、Wts、Yki在哺乳動物中對應(yīng)的同源蛋白分別是MST1/2(Mammalian Sterile 20-like kinases 1/2)、SAV1(Salvador homolog 1)、MOB1(MOBKL1A/MOBKL1B)、LATS1/2(Large tumor suppressor kinases 1/2)和轉(zhuǎn)錄共激活因子TAZ/YAP。 TAZ和YAP是Hippo信號通路的兩個核心下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子，屬于同源蛋白，具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。在上游信號因子的作用下，活化的MST1/2和SAV1磷酸化LATS1/2、MOB1并使其相互結(jié)合形成復(fù)合物，磷酸化TAZ/YAP，TAZ和YAP在細(xì)胞質(zhì)中被磷酸化后與14-3-3蛋白結(jié)合，進(jìn)一步被泛素化降解，參與正常組織代謝[14-15]；若該通路被阻斷或失活，TAZ和YAP在胞質(zhì)中未被磷酸化則進(jìn)入細(xì)胞核中，與TEA域家族成員(TEA domain family members,TEAD)等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與非正常的調(diào)節(jié)與代謝，影響細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲[16-17]。

目前研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌等多種人類腫瘤中都存在Hippo信號通路的異常，表明Hippo信號通路參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。TAZ和YAP是Hippo信號通路的兩個核心效應(yīng)分子，研究發(fā)現(xiàn)，TAZ在口腔鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，且高表達(dá)的TAZ與腫瘤大小、病理學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[4]；在胃癌中高表達(dá)的TAZ可通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)胃癌血管生成的能力[2]；而在非小細(xì)胞肺癌中，YAP通過調(diào)控長鏈非編碼RNA的表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增值和遷移[18]。此外，TAZ和YAP的表達(dá)異常與多種腫瘤的耐藥密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌中，YAP在吉西他濱、紫杉醇和順鉑等化療藥的耐藥中表達(dá)異常[19]；在乳腺癌中，過表達(dá)的TAZ導(dǎo)致癌細(xì)胞對紫杉醇耐藥，而沉默TAZ可增加乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的敏感性，而且TAZ被用來維持乳腺癌干細(xì)胞的特性，并導(dǎo)致這些細(xì)胞對紫杉醇和多柔比星的耐藥性[20]。本研究結(jié)果顯示：TAZ在TNBC組織中的陽性表達(dá)率為56.7%，高于non-TNBC組織(16.7%)，而YAP在TNBC組織中陽性表達(dá)率高達(dá)73.3%，也高于non-TNBC組織(43.3%)，提示TAZ和YAP與TNBC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；TAZ和YAP在腫瘤直徑大于2 cm的TNBC組織中表達(dá)較高；TNBC組的組織學(xué)分級以Ⅱ、Ⅲ級為主(29/30)，TAZ和YAP在分化較差的組織中陽性表達(dá)率高。腫瘤大小、組織學(xué)分級是公認(rèn)的乳腺癌預(yù)后因素，TAZ和YAP的表達(dá)與其相關(guān)，提示TAZ和YAP可能與TNBC的惡性程度高、預(yù)后差的特征有一定的相關(guān)性。

TNBC惡性程度高、侵襲性強(qiáng)，與其他類型乳腺癌相比具有較差的預(yù)后。本文通過免疫組織化學(xué)法檢測了60例乳腺癌組織中TAZ、YAP蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)兩者高表達(dá)于TNBC組織中，且與腫瘤大小、組織學(xué)分級有關(guān)；另外，在TNBC中TAZ和YAP的表達(dá)呈正相關(guān)，說明兩者在三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有相互協(xié)同作用。我們可以認(rèn)為Hippo信號通路在TNBC的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。但本次實驗的最大不足是樣本量過少，在后續(xù)研究中需要進(jìn)行大樣本、多中心統(tǒng)計驗證。因此，闡明Hippo信號通路在TNBC發(fā)生發(fā)展中的作用，為靶向TNBC的治療提供新的方向。