周鵬翔，信 波，宋曉鵬，孫啟會

解放軍第九六〇醫(yī)院泰安醫(yī)療區(qū)(泰安 271100)

視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)病率約占所有兒童期癌癥的3%，是最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤[1-2]，且其高度惡性，腫瘤細胞易通過視神經(jīng)直接進入到大腦中，或通過血液播散到肺、骨骼及人體其他器官而導致患者死亡[3]。在治療方面，盡管已經(jīng)有了諸多有效的治療方法并且取得了新的進展，但相當多的患者仍必須行眼球摘除術(shù)[4-6]。因此，探索視網(wǎng)膜母細胞瘤發(fā)生發(fā)展背后的分子調(diào)控機制，對尋找新的潛在治療靶點具有重要意義。作為非編碼RNA的重要成員，環(huán)狀RNA(Circular RNA,CircRNA)是一種由共價閉合環(huán)構(gòu)成的RNA分子，它的分子結(jié)構(gòu)決定了其穩(wěn)定性高，不容易被酶降解[7-8]。最近，大量研究表明，異常表達的CircRNAs參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[9-11]。而CircAKT3作為CircRNAs中的一員，其被證明參與了胃癌和肺癌的進展，在這兩種腫瘤中均起到癌基因作用，但其是否參與視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展，不得而知[12-13]。本實驗選取CircAKT3在視網(wǎng)膜母細胞瘤中進行研究，旨在為視網(wǎng)膜母細胞瘤的治療提供新的靶點。

材料與方法

1 實驗材料 ①主要試劑及設(shè)備：細胞培養(yǎng)瓶及孔板(美國Corning公司)；胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(杭州四季青公司)；通用RT-PCR試劑盒和2×Taq Plus PCR Master Mix試劑盒(北京索萊寶公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑及TRIzol溶液(美國Invitrogen公司)；Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博公司)；分光光度計(日本日立公司)；多功能酶標儀(瑞士Tecan公司)；梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)；熒光定量PCR儀(德國QIAGEN公司)；流式細胞儀(美國BD公司)。②細胞株：正常視網(wǎng)膜上皮細胞細胞ARPE-19和視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞SO-Rb50均購于美國ATCC。兩細胞株均采用含有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件設(shè)定為：飽和濕度、37 ℃和5 % CO2濃度。

2 實驗方法 ①細胞轉(zhuǎn)染：實驗所用SiRNA及其對照序列購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司。所有轉(zhuǎn)染均在6孔板內(nèi)進行，細胞鋪板24 h后開始轉(zhuǎn)染，此時處于對數(shù)生長期的細胞的匯合度約為50%。采用LipofectamineTM2000試劑進行轉(zhuǎn)染，SiRNA及其對照序列的轉(zhuǎn)染濃度為100 nmol/L，具體步驟參考LipofectamineTM2000操作手冊。②實驗分組：將實驗分為兩組，實驗組予以轉(zhuǎn)染CircAKT3的SiRNA，對照組轉(zhuǎn)染SiRNA序列的對照序列。③qRT-PCR實驗：采用TRIzol溶液提取細胞內(nèi)RNA，隨后采用通用RT-PCR試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，最后采用2×Taq Plus PCR MasterMix試劑盒進行qPCR反應(yīng)。CircAKT3上游引物： 5’-TCCAAATAAACGCCTTGGTGG-3’，下游引物：5’-CCTCAGAGAACACCCGCTCT-3’。GAPDH上游引物： 5’-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3’；下游引物：5’-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3’。④CCK-8實驗：待細胞轉(zhuǎn)染24 h后，離心收集實驗組和對照組細胞，進行3次細胞計數(shù)，計算4000細胞所需懸液體積，依次加入96孔板每孔，每孔終體積為100 μl，每組取6個復孔，一共鋪4塊板。每24 h取一塊孔板，每孔加入10 μl CCK-8溶液，在37 ℃放置1 h后，將孔板放入多功能酶標儀進行上機檢測。⑤細胞凋亡檢測：待細胞轉(zhuǎn)染48 h后，離心收集實驗組和對照組細胞，室溫下2000 r/min離心5 min，棄去上清。預冷的PBS將細胞重懸，繼續(xù)離心然后收集細胞，如此洗滌兩遍。將細胞濃度調(diào)整至1×106/ml，然后向每管中加入400 μl細胞懸液。每管加入 5 μl Annexin V-FITC溶液，輕輕搖勻后，在4 ℃避光孵育15 min。繼續(xù)加入5 μl PI溶液，在4 ℃避光孵育5 min。然后上機檢測。

結(jié) 果

1 視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞SO-Rb50中CircAKT3表達水平 為了初步明確CircAKT3可能在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的作用，實驗選擇以正常視網(wǎng)膜上皮細胞ARPE-19為參照來檢測視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞SO-Rb50中CircAKT3的表達水平。qRT-PCR實驗結(jié)果表明，相較于ARPE-19細胞，SO-Rb50細胞內(nèi)CircAKT3的表達水平明顯增高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖1)。結(jié)果提示SO-Rb50細胞中表達上升的CircAKT3可能起到促進腫瘤進展的作用。

注：與ARPE-19比較，**P<0.01

2 視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞SO-Rb50中CircAKT3 SiRNA沉默效率的驗證 為了進一步明確CircAKT3在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的作用，實驗選擇SiRNA來下調(diào)CircAKT3表達后再進行后續(xù)功能驗證。在轉(zhuǎn)染24 h后，采用qRT-PCR檢測實驗組和對照組中SO-Rb50細胞中CircAKT3的表達水平，結(jié)果顯示，實驗組在轉(zhuǎn)染SiRNA后，其細胞內(nèi)CircAKT3的表達水平與對照組相比明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

注：與對照組比較，*P<0.05

3 CircAKT3對視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞SO-Rb50增殖的影響 在下調(diào)SO-Rb50細胞內(nèi)CircAKT3的表達后，采用CCK-8實驗明確CircAKT3對SO-Rb50細胞增殖的影響。實驗組在通過轉(zhuǎn)染SiRNA下調(diào)CircAKT3的表達后，其細胞在72 h和96 h的OD值明顯低于對照組，結(jié)果表明，實驗組細胞在抑制CircAKT3的表達后，其在72 h和96 h的增殖速度較對照組明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。結(jié)果也表明CircAKT3本身可以提高SO-Rb50細胞的增殖能力，促進腫瘤進展。

注：與相應(yīng)時間點對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

4 CircAKT3對視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞SO-Rb50凋亡的影響 在下調(diào)SO-Rb50細胞內(nèi)CircAKT3的表達后，采用流式細胞儀檢測CircAKT3對SO-Rb50細胞凋亡的影響。實驗組在通過轉(zhuǎn)染SiRNA下調(diào)CircAKT3的表達后，其細胞的凋亡率為(7.71±0.396)%，對照組細胞的凋亡率為(3.51±0.478)%，實驗組凋亡率較對照組明顯增加，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖4)。結(jié)果也表明CircAKT3本身可以抑制SO-Rb50細胞的凋亡，促進腫瘤進展。

注：與對照組相比，***P<0.001

討 論

CircRNA是非編碼腫瘤基因組中的一個新成員，具有獨特的性質(zhì)和多樣的細胞功能，目前正在以穩(wěn)步增長的速度進行研究，已經(jīng)成為現(xiàn)在的研究熱點。CircRNAs在多種腫瘤中的作用已被探索并逐漸得到證實，例如，在膀胱癌中的一項研究中心，一些異常表達的CircRNAs在癌癥組織中被檢測出來，后續(xù)觀察到一個來自TCF25的CircRNA通過海綿吸附mir-103a-3p和miR-107促進膀胱癌細胞的增殖和遷移[14]。最近，來自MYLK的CircRNA被證明在膀胱癌中具有致癌作用，它與miR-29a結(jié)合，抑制了后者對其靶基因VEGFA的內(nèi)源性抑制作用，進而導致上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成和轉(zhuǎn)移[15]。同樣，在乳腺癌中，有研究表明來自ABCB10的CircRNA在乳腺癌中表達上調(diào)，體外敲除該CircRNA可抑制乳腺癌細胞的增殖并促進細胞凋亡[16]。此外，在結(jié)腸癌中，CIRS-7的高表達被證明與患者的生存不良相關(guān)[17]。在另一項研究中，通過RNA測序也發(fā)現(xiàn)一些CircRNAs在結(jié)直腸癌中顯著下調(diào)，暗示這些分子可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[18]。通過分析膠質(zhì)瘤和非腫瘤腦樣本的RNA測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了476個差異表達的CircRNAs。后續(xù)研究表明，一種源自VCAN基因的CircRNA被發(fā)現(xiàn)在少突膠質(zhì)細胞瘤和膠質(zhì)母細胞瘤中表達上調(diào)，該基因與膠質(zhì)瘤的發(fā)生有關(guān)[19]。

雖然現(xiàn)在CircRNA在腫瘤中的相關(guān)研究已經(jīng)成為熱點，但是有關(guān)CircRNA在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的研究報道不多。在本研究中，我們對CircAKT3在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的表達水平以及功能進行了檢測，證實了CircAKT3在視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中高表達，且其會促進腫瘤細胞增殖和抑制細胞凋亡。研究結(jié)果同CircAKT3在肺癌和胃癌中的報道一致，都是起到癌基因作用，促進腫瘤進展[12-13]。

研究表明，CircRNA具有miRNA的ceRNA 作用，CircRNA可通過海綿吸附miRNA來抑制miRNA的活性，并在調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和與蛋白質(zhì)的結(jié)合中發(fā)揮作用[20]。例如，CircAmotl1可以通過海綿吸附miR-17-5p調(diào)節(jié)Dnmt3a和STAT3的表達來加速傷口的修復[20]。同樣，Circ-0001564通過抑制miR-29c-3p作用來影響骨肉瘤的發(fā)展[21]。研究表明，CircRNA-100290在口腔鱗癌中可促進癌細胞體外增殖，后續(xù)的機制研究表明，CircRNA-100290與miR-29家族成員可直接結(jié)合并解除后者對于CDK6 的抑制，從而促進癌細胞的增殖[22]。此外，CircRNA-103809在結(jié)直腸癌組織中低表達，并與腫瘤組織的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，機制研究結(jié)果表明，CircRNA-103809在結(jié)直腸癌中是通過作用于miR-532-3P/FOXO4軸進而參與大腸癌生物學功能的調(diào)節(jié)[23]。

關(guān)于CircAKT3,它已被證明可海綿吸附miR-516b-5p和miR-198，但其在視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中是否通過上述兩個miRNAs發(fā)揮作用，需要進行下一步研究[12-13]。

本研究證實了CircAKT3在視網(wǎng)膜母細胞瘤中可促進細胞增殖和抑制細胞凋亡，雖然其具體作用機制還需要進一步證明，但它的發(fā)現(xiàn)也為視網(wǎng)膜母細胞瘤的治療提供了新的思路和靶點。