王 蕊,尚粉青,葉玉蘭,郭 瑄

1.西安高新醫(yī)院心內(nèi)科(西安710075)；2.西安市第一醫(yī)院心內(nèi)科(西安710002)

肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary hypertension,PAH)發(fā)病隱匿,診療棘手，預(yù)后差。近年來(lái)研究表明，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是導(dǎo)致PAH肺血管異常收縮、肺血管重構(gòu)和肺部血栓形成的主要原因[1]。Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子2(Kruppel-like factor2,KLF2)在肺組織高度表達(dá),近來(lái)研究表明其在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生物活性中起重要作用[2]，因此我們預(yù)測(cè)其在PAH發(fā)生過(guò)程中可能起重要作用。本研究通過(guò)腹腔注射野百合堿(Monocrotaline,MCT)建立大鼠PAH模型,觀察KLF2及其相關(guān)因子表達(dá)變化,以期為進(jìn)一步研究PAH干預(yù)措施提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，8～10周齡，體重(200±10)g，購(gòu)于西安交通大學(xué)動(dòng)物研究中心，飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院心血管研究中心動(dòng)物房；動(dòng)物房為清潔級(jí)，動(dòng)物的飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃，標(biāo)準(zhǔn)12 h光照12 h黑暗節(jié)律，普通專用大鼠合成飼料喂養(yǎng)和飲水。野百合堿由購(gòu)自Sigma公司。PCR引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成。β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz公司；eNOS抗體、KLF2、ET-1抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。NK-κB抗體、VEGFR2抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑(德國(guó)Roche公司)，ECL發(fā)光液(Vazyme公司，Millipore公司)，Trizol 試劑(Invitrogen公司)，HiScriptTMqPCR Super Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme公司)，PCR DNA聚合酶(Vazyme公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)時(shí)定量PCR儀及梯度PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems 公司)，WB電泳儀和電泳槽、WB半干轉(zhuǎn)膜槽(BIO-RAD公司)，自動(dòng)洗片機(jī)(柯達(dá)公司)。

2 動(dòng)物模型的建立 所有實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)將其分為對(duì)照組(10只)、PAH模型組(MCT組，14只)，均在同等條件下喂養(yǎng)。對(duì)照組按60 mg/kg腹腔注射0.9%氯化鈉溶液，MCT組按60 mg/kg腹腔一次性注射MCT造模。

3 血流動(dòng)力學(xué)和心室肥厚檢測(cè) MCT注射造模4 周后,稱量?jī)山M大鼠體重 (BW),水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉,連接壓力換能器,將微導(dǎo)管 (PE50) 沿著大鼠頸外靜脈插入右心室,此時(shí)可見(jiàn)振幅較大的右心室波,并記錄右心室收縮壓(RVSP)。處死動(dòng)物后取出心肺組織,去除心房及大血管,分離右心室和左心室以及室間隔,濾紙吸干組織并測(cè)量右心室質(zhì)量(RV)、左心室質(zhì)量(LV)和室間隔質(zhì)量(S),計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(RVHI)=右心室RV/(左心室LV+室間隔S)、右心室質(zhì)量指數(shù)(RVMI) =RV/BW(mg/g)。肺組織標(biāo)本一部分組織分成1 cm×1 cm×1 cm大小迅速存放于液氮中,后于-80 ℃凍存,用于分子生物學(xué)研究。剩余部分用4%多聚甲醛溶液固定。

4 血清各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定 使用ELISA試劑盒測(cè)定血清中白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)及內(nèi)皮素-1(ET-1)水平變化。采用硝酸還原酶法測(cè)定血清一氧化氮(NO)含量。

5 肺組織各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定 ①取肺組織50 mg，剪碎，加入Trizol 1 ml超聲勻漿，提取組織RNA，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法測(cè)定肺組織中KLF2及核因子-κB(NK-κB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)、內(nèi)皮素-1(ET-1)、一氧化氮合酶(eNOS)各因子的表達(dá)變化。PCR引物序列見(jiàn)表1。②取肺組織80 mg/只，剪碎組織，加入蛋白裂解液約300 ml，勻漿機(jī)勻漿，3次，每次30 s；液氮凍融3次，4℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清，ABC法測(cè)定蛋白濃度;Western blot方法測(cè)定肺組織中上述各因子的蛋白表達(dá)的變化。

表1 RT-PCR引物列

結(jié) 果

1 一般情況觀察及基本數(shù)據(jù) MCT組在腹腔注射第2周開始出現(xiàn)毛發(fā)枯糙、喘息、食量減少，第25、26天分別有1只大鼠死亡，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組無(wú)死亡。MCT組大鼠RVSP較正常對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，提示PAH模型制備成功(圖1A)；正常對(duì)照組大鼠右心室形態(tài)正常，RVHI為(23.7±2.1)%，MCT組大鼠RVHI較正常對(duì)照組顯著增高(33.2±2.2)%(P<0.01)(圖1B)；正常對(duì)照組大鼠RVMI為(0.81±0.15)%，MCT組大鼠RVMI較正常對(duì)照組顯著增高(1.25±0.24)%(P<0.01)(圖1C)。

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01

2 兩組大鼠肺組織中KLF2及NK-κB、VEGFR2、ET-1、eNOS各因子表達(dá)比較 RT-PCR結(jié)果提示，MCT組大鼠肺組織中KLF2及eNOS的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低；而NK-κB、VEGFR2及ET-1的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高。Western blot結(jié)果提示，MCT組大鼠肺組織中KLF2及eNOS的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著降低；而NK-κB、VEGFR2及ET-1的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增高。見(jiàn)圖2、3。

注：與對(duì)照組相比，**P<0.01 注：與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

3 兩組大鼠血清中IL-1β、IL-6及ET-1、NO水平測(cè)定結(jié)果 MCT組大鼠血清中IL-1β、IL-6及ET-1水平較對(duì)照組顯著升高，而NO水平較對(duì)照組顯著降低，見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠血清各因子表達(dá)情況

4 大鼠肺組織表達(dá)KLF2情況與血清各因子的相關(guān)性分析 見(jiàn)圖4。

圖4 大鼠肺組織KLF2與血清各因子相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：KLF2與血清IL-1β(r=-0.617,P=0.0006)(圖4A)、IL-6(r=-0.539，P=0.021)(圖4B)及ET-1(r=-0.881，P=0.006)(圖4C)呈顯著負(fù)相關(guān)，而與血清NO含量呈顯著正相關(guān)(r=0.721，P=0.001)(圖4D)。

討 論

肺動(dòng)脈高壓指肺動(dòng)脈壓異常升高的一種病理生理狀態(tài)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全明確。目前治療主要集中在抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖及肺血管收縮，波生坦作為一種ET-1受體拮抗劑應(yīng)用于臨床取得了可喜的療效[3]；西地那非為磷酸二酯酶V選擇性抑制劑，能增強(qiáng)NO釋放；外源性前列環(huán)素類似物，主要通過(guò)擴(kuò)張肺動(dòng)脈血管床[4]。亦有多種中藥顯示出一定的控制肺動(dòng)脈高壓的作用[5-6]。上述藥物雖然可以改善生活質(zhì)量，但是仍不能有效改善預(yù)后。因此需要進(jìn)一步探討其發(fā)病上游更重要、更集中的因素所在，為進(jìn)一步研究治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

目前有觀點(diǎn)表明，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂是PAH發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。KLF2作為KLF家族中重要的轉(zhuǎn)錄因子,在內(nèi)皮功能調(diào)控中起重要作用。我們推測(cè)KLF2在PAH發(fā)病過(guò)程中可能有以下作用機(jī)制。①調(diào)節(jié)血管活性因子的生成：KLF2可抑制ET-1和ACE的表達(dá)，降低縮血管物質(zhì)的生成[7]；同時(shí)可直接結(jié)合到eNOS基因啟動(dòng)子增加其轉(zhuǎn)錄活性[8]，效誘導(dǎo)e NOS的表達(dá)，使血管NO生成增加。②越來(lái)越多的證據(jù)表明，炎癥反應(yīng)在肺動(dòng)脈高壓病理改變的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-10]；如炎癥因子IL-1β、IL-6、MCP-1及TNF-a均明顯增高[11]；KLF2通過(guò)抑制炎性因子IL-1β、IL-18等的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[12]。研究表明[13]NF-κB在肺高壓大鼠肺組織表達(dá)顯著增高，參與肺高壓發(fā)展過(guò)程中氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的調(diào)控過(guò)程。KLF2可能與抑制NF-κB通路的多個(gè)組件相互作用,降低NF-κB的活性,間接發(fā)揮抗炎作用[14]。③血管增生重構(gòu)：KLF2與VEGFR2啟動(dòng)子結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞VEGFR2的表達(dá)[15]，從而有抑制血管生成的作用；另有研究報(bào)道KLF2可抑制低氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)，抑制低氧誘導(dǎo)的血管生成[7]。

本研究結(jié)果揭示PAH大鼠肺組織KLF2表達(dá)明顯減少。前期相關(guān)研究[16]亦揭示缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織KLF2顯著降低，AMPK磷酸化ACE2后可誘導(dǎo)KLF2表達(dá)增加從而緩解肺高壓進(jìn)展。肺動(dòng)脈高壓縮血管物質(zhì)ET-1表達(dá)顯著增加，而e NOS表達(dá)降低，NO生成減少，ET-1與NO均可被KLF2調(diào)控其表達(dá)，提示KLF2為多種血管活性物質(zhì)的共同調(diào)節(jié)因子。同時(shí)，PAH大鼠肺組織NF-κB表達(dá)顯著增加，血清IL-1β表達(dá)亦明顯增高，提示炎癥因子表達(dá)明顯增高，KLF2可調(diào)節(jié)NF-κB的 表達(dá)及活性，從而對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)過(guò)程起到調(diào)控作用。由本研究結(jié)果可推測(cè)，KLF2在PAH發(fā)病發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用，是多種血管活性物質(zhì)生成的上游調(diào)節(jié)因素，是炎癥反應(yīng)的上游調(diào)控因子，是血管重構(gòu)的調(diào)節(jié)因素。因此，針對(duì)KLF2來(lái)進(jìn)行PAH的治療干預(yù)措施的研究將是未來(lái)的方向之一。