孫培松，李博涵，申彥，張?chǎng)?，曲芃芃

宮頸癌發(fā)病率在婦女惡性腫瘤中位居第三，絕大多數(shù)死亡病例發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家。流行病學(xué)資料以及實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)明確高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌前病變及宮頸癌的必要條件[1]。隨著HPV疫苗的應(yīng)用、檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)展及篩查策略的不斷成熟，目前宮頸癌的預(yù)防成效顯著。將HPV檢測(cè)作為宮頸病變的初篩手段已逐步成為諸多國(guó)家宮頸癌篩查的共識(shí)。對(duì)于持續(xù)HR-HPV陽(yáng)性患者的宮頸病變風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)逐漸受到人們的重視，發(fā)現(xiàn)持續(xù)HR-HPV感染進(jìn)展為癌前病變進(jìn)而發(fā)展為宮頸癌的熱點(diǎn)基因意義重大，可以成為早期干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)[2-3]。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法，檢索并發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織與宮頸癌組織中差異表達(dá)基因指向分化抗原簇蛋白 24（cluster of differentiation 24，CD24），該基因最初被認(rèn)為是人體內(nèi)連接糖基化磷脂酰肌醇的B細(xì)胞相關(guān)抗原，也被用作B細(xì)胞和胸腺細(xì)胞標(biāo)志物。隨后研究發(fā)現(xiàn)CD24在卵巢癌、食道癌、結(jié)腸癌、膽管癌、肺癌、胃癌、腎癌、膀胱癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等多種人類癌癥中異常表達(dá)，且與患者生存率較低相關(guān)[4-5]。但CD24與宮頸癌的關(guān)系少有報(bào)道，本研究進(jìn)一步探究CD24與宮頸癌臨床病理聯(lián)系以及與宮頸癌無(wú)進(jìn)展生存期（DFS）及總生存期（OS）的關(guān)系，以此來(lái)評(píng)估CD24作為宮頸病變預(yù)測(cè)指標(biāo)的臨床價(jià)值，并對(duì)CD24的作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選用通量癌基因數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA門戶網(wǎng)站GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/）以及 UALCAN 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://UALCAN//ualcan.path.uab.edu/）。

1.2 差異基因篩選 通過(guò)TCGA門戶網(wǎng)站（http://gepia.cancer-pku.cn/）進(jìn)行差異基因分析、基因的篩選以及臨床預(yù)后分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：在早期宮頸癌（Ⅰ期）患者中高表達(dá)的基因。排除標(biāo)準(zhǔn)：在陰道宮旁浸潤(rùn)宮頸癌（Ⅱ期）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移性宮頸癌（Ⅲ期+Ⅳ期）患者中的表達(dá)高于在早期宮頸癌患者中表達(dá)的基因。之后通過(guò)差異倍數(shù)及P值選取差異性較高的基因，通過(guò)文獻(xiàn)分析其中可能具有較高臨床意義的基因作為目的基因。并通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)（http://UALCAN//ualcan.path.uab.edu/）進(jìn)行數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

1.3 免疫組織化學(xué)（免疫組化） 病理診斷按世界衛(wèi)生組織（WHO）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，選取2019年6月—2020年3月天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院（我院）就診的患者中正常宮頸上皮組織、高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變[HSIL，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅱ～Ⅲ]組織、ⅠA期宮頸癌組織石蠟切片各5例?；颊吣挲g為43～60歲，正常宮頸上皮組織均來(lái)自因子宮腺肌病行子宮全切術(shù)的患者。進(jìn)行CD24免疫組織化學(xué)染色：切片脫蠟水化、抗原修復(fù)、封閉、滴加一抗[CD24（博奧森 bs-23867R）1∶200 稀釋]、滴加二抗、DAB顯色。

1.4 蛋白互作關(guān)系分析 蛋白互作關(guān)系通過(guò)string數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）進(jìn)行分析。交互分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.4，最大交互因子設(shè)定為不超過(guò)20個(gè)交互因子。并通過(guò)GO數(shù)據(jù)庫(kù)以及KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交互因子進(jìn)行富集分析，篩選富集功能及通路。

1.5 核心基因的選擇 采用cytoscape中的cytohubba工具，對(duì)string數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建并采用計(jì)算公式（MCC方法）選出連接點(diǎn)最為集中的前3位核心基因。

1.6 GO以及KEGG富集分析 將string數(shù)據(jù)庫(kù)中分子間關(guān)聯(lián)進(jìn)行GO富集分析，并通過(guò)R語(yǔ)言中的GOplot及string軟件包結(jié)合各分子在宮頸癌及正常人群中的表達(dá)差異倍數(shù)篩選上調(diào)基因及富集通路。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 定量資料的組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier生存分析和Log-rank檢驗(yàn)分析宮頸癌患者CD24表達(dá)水平對(duì)DFS和OS的影響，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO以及KEGG富集分析采用矯正后P值，矯正后P＜0.05為富集結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選 通過(guò)TCGA分析發(fā)現(xiàn)正常宮頸組織與宮頸癌組織之間存在2 094個(gè)差異基因。根據(jù)研究目的對(duì)正常組與早期宮頸癌組（Ⅰ期）進(jìn)行差異基因分析，得到248個(gè)差異基因；并分析早期宮頸癌組（Ⅰ期）與陰道宮旁浸潤(rùn)組（Ⅱ期）以及宮頸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（Ⅲ期+Ⅳ期）的差異基因，分別發(fā)現(xiàn)346個(gè)和468個(gè)差異基因，將其與正常組和早期宮頸癌組的差異基因取交集并予以排除。考慮剩余基因主要與早期腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展相關(guān)，共計(jì)剩余53種，再選擇出差異倍數(shù)＞16倍且P＜0.01的基因。通過(guò)進(jìn)一步查詢文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)CD24可能具有較高的臨床價(jià)值，因而將其作為目的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。差異基因篩選流程見(jiàn)圖1。

圖1 差異基因篩選流程圖

2.2 數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證CD24臨床表達(dá) 通過(guò)對(duì)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)中患者信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因CD24在宮頸癌組織（n=298）中的表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織（n=3，P＜0.01）。根據(jù)臨床分期對(duì)患者進(jìn)行分組并進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CD24在早期宮頸癌（Ⅰ期）組織（n=161）中的表達(dá)顯著高于正常宮頸組織（n=3，P＜0.05），說(shuō)明 CD24在宮頸癌早期發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用；CD24在Ⅰ期（n=161）與Ⅱ期宮頸癌患者（n=69）、Ⅰ期（n=161）與Ⅲ期及Ⅳ期（n=68）宮頸癌患者之間的表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），且均值略低于早期宮頸癌表達(dá)水平，說(shuō)明CD24可能不是驅(qū)動(dòng)宮頸癌進(jìn)一步浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的相關(guān)基因。見(jiàn)圖2。

將CD24中位數(shù)作為閾值，分別將宮頸癌患者分為CD24高表達(dá)組及CD24低表達(dá)組。通過(guò)未加權(quán)生存分析發(fā)現(xiàn)，2組DFS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.49），但CD24高表達(dá)組的OS顯著低于CD24低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.045），其可能與患者的預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。見(jiàn)圖3（見(jiàn)后插二）。

2.3 HSIL與早期宮頸癌中CD24表達(dá)差異分析 對(duì)我院收集的宮頸正常者、HSIL患者以及早期宮頸癌患者的宮頸組織進(jìn)行免疫組化分析，觀察3組CD24表達(dá)的差異。棕色為免疫組化染色陽(yáng)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD24在HSIL以及早期宮頸癌患者中表達(dá)逐漸增加，在早期宮頸癌患者的表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，而在HSIL與正常宮頸組織分別為弱陽(yáng)性及陰性。見(jiàn)圖4（見(jiàn)后插二）。

2.4 CD24對(duì)于早期宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制探索 通過(guò)string數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CD24進(jìn)行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析發(fā)現(xiàn)各分子互作關(guān)系網(wǎng)見(jiàn)圖5（見(jiàn)后插二）。通過(guò)cytoscape對(duì)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步分析，從而對(duì)其中起主要調(diào)控作用的核心基因進(jìn)行篩選，共篩選出3個(gè)核心基因，其節(jié)點(diǎn)關(guān)聯(lián)性排名依次為CD24、CD44以及TP53，見(jiàn)圖6（見(jiàn)后插二）。

進(jìn)一步的CD24及其相關(guān)核心基因?qū)?yīng)蛋白的GO富集分析結(jié)果包括生物過(guò)程（GO-BP）、分子功能（GO-MF）、細(xì)胞成分（GO-CC），見(jiàn)表1。其中GO-BP主要富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)正調(diào)控以及細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)正調(diào)控，兩者均與激活或增加細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的頻率、速率或程度的生物過(guò)程相關(guān)；GO-MF提示其主要功能與蛋白結(jié)合以及酶結(jié)合結(jié)構(gòu)相關(guān)；GO-CC分析提示CD24基因?qū)?yīng)蛋白主要位于細(xì)胞表面以及脂膜外側(cè)。根據(jù)基因表達(dá)差異分析其對(duì)應(yīng)蛋白功能均為正調(diào)控，見(jiàn)圖7（見(jiàn)封三）。

圖2 CD24表達(dá)差異數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證

進(jìn)一步對(duì)CD24基因進(jìn)行KEGG通路分析，結(jié)果提示其與癌癥發(fā)展的信號(hào)通路密切相關(guān)：包括癌癥通路以及癌癥的微小RNA（microRNAs）通路，之后在磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路發(fā)生富集（矯正后P＜0.05）。根據(jù)KEGG注釋該通路由生長(zhǎng)因子與其受體酪氨酸激酶結(jié)合后激活調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯、增殖等功能，同時(shí)也是腫瘤增殖生長(zhǎng)的重要通路之一。見(jiàn)圖8（見(jiàn)封三）。

表1 CD24及其相關(guān)基因?qū)?yīng)蛋白的GO富集分析結(jié)果

圖3 CD24表達(dá)在宮頸癌患者中的生存曲線分析

圖4 CD24在正常宮頸組織、HSIL以及早期宮頸癌組織中的表達(dá)（免疫組化×100）

圖5 CD24蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 CD24及其相關(guān)核心基因作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 CD24及其相關(guān)基因?qū)?yīng)蛋白GO功能富集分析

圖8 CD24及其相關(guān)蛋白KEGG通路分析

3 討論

近年來(lái)，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念對(duì)醫(yī)學(xué)產(chǎn)生了巨大影響，尤其在腫瘤領(lǐng)域。針對(duì)宮頸癌同樣有許多相關(guān)的生物信息技術(shù)分析，由于公共數(shù)據(jù)庫(kù)的局限以及目前的關(guān)注熱點(diǎn)，大多數(shù)的數(shù)據(jù)挖掘分析集中于潛在的治療靶點(diǎn)以及影響宮頸癌預(yù)后的指標(biāo)[6]，較少有生物信息研究集中于早期宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展以及宮頸病變預(yù)測(cè)指標(biāo)。

CD24又稱熱穩(wěn)定抗原，是一種高度糖基化的糖基磷脂酰肌醇錨定表面蛋白，已知與先天免疫細(xì)胞上的 SIGLEC10（sialic-acid-binding Ig-like lectin 10）相互作用，抑制響應(yīng)感染、敗血癥、肝損傷和慢性移植物抗宿主疾病的破壞性炎癥反應(yīng)[7-8]。然而，也有研究顯示CD24表達(dá)于多種實(shí)體腫瘤，但該分子在調(diào)節(jié)腫瘤免疫反應(yīng)中的作用尚未被證實(shí)[9-10]。

本研究通過(guò)設(shè)計(jì)篩選流程，分析正常組與早期宮頸癌組（Ⅰ期）之間的差異基因，并分析早期宮頸癌組（Ⅰ期）與陰道宮旁浸潤(rùn)組（Ⅱ期）以及宮頸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組（Ⅲ期+Ⅳ期）的差異基因，予以排除。從臨床病理角度篩選出可能與宮頸癌變發(fā)生、發(fā)展相關(guān)并可能作為宮頸病變預(yù)測(cè)指標(biāo)的基因——CD24。通過(guò)其他數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證該基因表達(dá)變化主要發(fā)生于宮頸癌早期。隨后，研究通過(guò)免疫組化分析正常、HSIL以及早期宮頸癌患者宮頸組織CD24的表達(dá)差異，結(jié)果與數(shù)據(jù)發(fā)掘的假設(shè)結(jié)果相符，即正常宮頸組織的CD24表達(dá)較低，而在宮頸病變及早期宮頸癌中表達(dá)逐漸上升，考慮其可能作為臨床預(yù)測(cè)宮頸病變進(jìn)展的潛在指標(biāo)。為了進(jìn)一步尋找依據(jù)，本研究通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CD24的可能作用機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的分析挖掘。通過(guò)string數(shù)據(jù)庫(kù)分析以及核心基因的計(jì)算，發(fā)現(xiàn)CD24的功能與CD44以及TP53基因密切相關(guān)。根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)注釋，CD44主要與細(xì)胞間黏附力相關(guān)，而TP53則是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中極為重要的因子之一。為了進(jìn)一步探究CD24基因的功能，本研究進(jìn)行了GO富集分析，其主要富集于信號(hào)通路正調(diào)控，通過(guò)GO注釋以及文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)，許多腫瘤通路相關(guān)基因，包括表皮生長(zhǎng)因子通路以及PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)基因均有許多富集于此功能區(qū)，該功能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。最后，研究進(jìn)行了KEGG信號(hào)通路富集分析，富集結(jié)果與GO富集分析結(jié)果相互印證。考慮CD24可能通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路影響宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展[11-12]。

目前，在宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)CD24往往與CD44共同表達(dá)，可作為宮頸腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記蛋白之一[5,13]。與成熟的宮頸細(xì)胞相比，CD24高表達(dá)的宮頸癌細(xì)胞往往同時(shí)表達(dá)低分化細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白波形蛋白以及oct4，提示CD24可能與宮頸細(xì)胞的去分化過(guò)程存在一定的相關(guān)性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，CD24高表達(dá)的SiHa細(xì)胞增殖速度增加，且抗凋亡能力更強(qiáng)，與本研究分析的結(jié)果相符。同時(shí)，部分研究發(fā)現(xiàn)CD24高表達(dá)可能增加宮頸癌細(xì)胞抗照射能力，使腫瘤對(duì)放療的敏感度降低，從而影響宮頸癌患者的治療效果及預(yù)后[5,14]。

本研究通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)門戶分析出對(duì)于早期宮頸癌發(fā)生、發(fā)展較為重要的基因CD24，并通過(guò)免疫組化首次驗(yàn)證了CD24在HSIL以及早期宮頸癌中的表達(dá)水平升高，為臨床宮頸病變風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)提供新的可能指標(biāo)。但是本研究為初部探索性研究，納入的病例較少，因而無(wú)法進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在之后的研究中將進(jìn)一步增加樣本量，同時(shí)對(duì)納入患者展開前瞻性研究，探討CD24表達(dá)對(duì)患者的長(zhǎng)期影響。

綜上所述，考慮CD24在早期宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可通過(guò)增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。同時(shí)，由于CD24在宮頸病變以及癌組織中的差異表達(dá)，其可能具有宮頸病變風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的臨床意義。隨后課題組將針對(duì)CD24進(jìn)行進(jìn)一步的研究以及臨床隨訪，探究CD24在宮頸病變臨床預(yù)測(cè)中的臨床價(jià)值。