褚曉潔，趙儒楠，查笑君，高用順

(1. 浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004； 2. 北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093；3. 南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

維生素C(Vitamin C, Vc)又稱抗壞血酸，是一種水溶性維生素，是生物體中重要的抗氧化劑[1]和輔酶因子[2]。Vc以脫氫抗壞血酸DHA和L-抗壞血酸AsA兩種形式廣泛存在于植物體內(nèi)，具有抵抗氧化脅迫、提高植物抗逆性等作用，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必不可少[3]。Vc作為一種高效抗氧化劑，參與人體多種代謝反應(yīng)，是人體必不可少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抵抗衰老的良好物質(zhì)。Vc可以清除人體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧自由基，從而起到預(yù)防癌癥、抗衰老、抗心血管疾病的作用[4-5]；亦可促進(jìn)膠原蛋白的合成[6]，從而使人體傷口快速愈合；還具有治療壞血病，提高人體免疫力等作用，是維持人類生命活動(dòng)不可或缺的有機(jī)物質(zhì)。近年來(lái)隨著科技的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)人與天竺鼠等動(dòng)物自身不能合成Vc，而其它動(dòng)物可以在肝臟或腎臟中合成自身所需要Vc[7-8]。隨著科技的發(fā)展研究人員逐漸發(fā)現(xiàn)，由于人體缺乏L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯氧化酶而喪失了合成Vc的能力[9]，人類只能通過(guò)外界食物獲取Vc，而水果和蔬菜中富含的Vc，是人類攝取Vc的主要來(lái)源。

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)為薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)的多年生草本植物[10-11]，其果肉鮮美，含有特殊的濃郁芳香，是世界上最受歡迎的水果之一[12-13]。草莓屬植物廣泛分布于我國(guó)以及世界各地[14-15]，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界現(xiàn)有草莓栽培品種多達(dá)2000余個(gè)，已成為全球重要的水果與經(jīng)濟(jì)作物。草莓的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，風(fēng)味獨(dú)特，含有豐富的Vc，具有“水果皇后”之稱，深受各國(guó)人民的喜愛(ài)。目前我國(guó)各地均有草莓種植，據(jù)中國(guó)園藝學(xué)會(huì)草莓分會(huì)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)草莓總產(chǎn)量達(dá)500萬(wàn)噸，在各農(nóng)作物與水果中草莓增幅名列前茅[16]。Vc與人類健康密切相關(guān)，但是人體自身不能合成，必須從食物中獲取，因此研究草莓中Vc的合成及調(diào)控機(jī)制，改良草莓組織中Vc的含量對(duì)草莓的自身生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆生長(zhǎng)以及對(duì)人類健康都具有重要的意義。目前諸多植物中Vc代謝途徑已逐漸清晰，而草莓中Vc合成機(jī)制尚不明確，擬對(duì)現(xiàn)有Vc合成機(jī)制以及草莓Vc合成研究情況加以梳理，以期為今后草莓Vc合成機(jī)制的研究提供指導(dǎo)。

1 植物Vc合成途徑

早在20世紀(jì)初，Holst和Fr?lich[17]通過(guò)“喂飼實(shí)驗(yàn)”發(fā)現(xiàn)老鼠和其它動(dòng)物不會(huì)患?jí)难?，但天竺鼠在長(zhǎng)期不服用新鮮蔬果后會(huì)患?jí)难　；蛟S是出于對(duì)了解人類自身Vc合成途徑的迫切需要，上世紀(jì)50年代，Vc在動(dòng)物體內(nèi)的生物合成途徑已被很好地理解。隨后Chatterjee[18]便發(fā)現(xiàn)由于人類缺乏L-古洛糖酸-1，4-內(nèi)酯氧化酶而不能在體內(nèi)合成Vc。迄今為止動(dòng)物Vc合成途徑就一直領(lǐng)先于植物，或許是植物體內(nèi)Vc合成途徑較為復(fù)雜，直到20世紀(jì)末植物體內(nèi)Vc合成途徑開(kāi)始被較清晰地解釋。到目前為止植物體內(nèi)可能存在4條Vc的合成途徑，即：L-半乳糖途徑(D-甘露糖途徑)、D-半乳糖醛酸途徑、古洛糖酸途徑和肌醇途徑(圖1)。

圖1 Vc生物合成途徑

1.1 L-半乳糖/D-甘露糖途徑(L-Gal/D-Man)

該途徑是Wheeler等[19]在前人研究基礎(chǔ)上，以同位素示蹤法并結(jié)合生化分析等手段提出來(lái)的，隨后大量的實(shí)驗(yàn)對(duì)此途徑展開(kāi)研究與驗(yàn)證，目前L-半乳糖/D-甘露糖途徑已是公認(rèn)的高等植物Vc合成的最重要和最主要且最被接受的途徑。L-半乳糖/D-甘露糖途徑自葡萄糖開(kāi)始，合成途徑中的所有基因均已被識(shí)別[20]。Wheeler等[19]以同位素標(biāo)記的L-半乳糖培養(yǎng)豌豆和擬南芥，發(fā)現(xiàn)D-甘露糖和L-半乳糖是Vc合成的有效前體，并發(fā)現(xiàn)在豌豆和擬南芥中L-半乳糖脫氫酶(GalDH)可催化L-半乳糖氧化成L-半乳糖酸-1，4-內(nèi)酯(GalLDH)。Dowdle等[21]發(fā)現(xiàn)該途徑是擬南芥中Vc生物合成的主要途徑。Conklin等[22]通過(guò)抗壞血酸缺陷型突變體，在L-半乳糖/D-甘露糖途徑中鑒定了VTC1、VTC2、VTC3、VTC4和VTC5這5個(gè)與抗壞血酸相關(guān)基因。隨著編碼 GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GGP)的VTC2和VTC5基因被鑒定出來(lái)，L-半乳糖/D-甘露糖途徑中所有參與基因均被鑒定出來(lái)[23-24]。

近年來(lái)L-半乳糖/D-甘露糖途徑依然是植物Vc合成途徑研究的熱點(diǎn)，Yoshimura等[25]在連續(xù)光照與黑暗處理，發(fā)現(xiàn)VTC2過(guò)表達(dá)導(dǎo)致擬南芥等植物Vc含量增加。Shiroma等[26]發(fā)現(xiàn)當(dāng)編碼GGP的VTC2基因表達(dá)會(huì)導(dǎo)致擬南芥Vc含量增加，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)L-半乳糖途徑也參與了擬南芥根系中Vc的合成。Qin等[27]發(fā)現(xiàn)GDP-甘露糖焦磷酸化酶(VTC1)的幾個(gè)同源基因OsVTC1-1和OsVTC1-3參與了Vc的合成，它們可能分別參與了葉片和根系中Vc的合成。Vidal-Meireles等[28]在對(duì)衣藻Vc生物合成和基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，GGP在衣藻Vc合成中起著關(guān)鍵作用，即使衣藻Vc合成調(diào)控機(jī)制與陸地植物略有不同，但仍受L-半乳糖/D-甘露糖途徑高度調(diào)控。Caviglia等[29]利用兩個(gè)獨(dú)立的擬南芥突變體，研究乙烯在影響光合作用和生長(zhǎng)的氧化還原信號(hào)途徑中的作用，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變體在GDP-L-半乳糖磷酸化酶合成基因中都有缺陷。黃曉婧等[30]克隆并分析了甜櫻桃‘佐藤錦’果實(shí)中PacGalDH和PacGalLDH基因，分析發(fā)現(xiàn)在‘佐藤錦’果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，PacGalDH表達(dá)量與Vc含量變化基本一致。

1.2 D-半乳糖醛酸途徑

早在上世紀(jì)50年代研究人員便提出了D-半乳糖醛酸途徑，但因科研手段有限，缺乏充足的證據(jù)而未被及時(shí)的證明，D-半乳糖醛酸途徑來(lái)源于植物細(xì)胞壁果膠成分D-半乳糖醛，經(jīng)若干酶促反應(yīng)最終合成Vc，但D-半乳糖醛酸途徑中僅有GalUR基因被克隆。Isherwood等[31]用D-半乳糖醛甲酯澆灌水芹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水芹Vc含量明顯增加，因而推測(cè)植物Vc合成途徑可能是D-半乳糖醛酸途徑。Agius等[32]在對(duì)草莓Vc合成途徑的研究中發(fā)現(xiàn)，GalUR是草莓中影響Vc合成的關(guān)鍵基因，隨后將從草莓中克隆的GalUR在擬南芥中過(guò)表達(dá)，擬南芥Vc含量提高2～3倍，從分子機(jī)制上證實(shí)了D-半乳糖醛酸途徑的存在。

Melino等[33]在葡萄果實(shí)中也檢測(cè)到了GalUR基因，也進(jìn)一步證實(shí)了D-半乳糖醛酸途徑的存在。隨后Cruz-Rus等[34]在對(duì)葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中Vc合成相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)VvGalUR基因的表達(dá)量隨著Vc含量的增加而上調(diào)，且VvGalUR基因的表達(dá)受高光照的調(diào)節(jié)，因而推測(cè)D-半乳糖醛酸途徑參與了葡萄果實(shí)成熟過(guò)程中Vc的合成。Jiang等[35]對(duì)獼猴桃Vc合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)獼猴桃Vc合成是由L-半乳糖、D-半乳糖醛酸等途徑共同完成的，且GalDH、GMP、GPP、GGP、GalUR等基因?qū)ΛJ猴桃果實(shí)Vc合成具有重要的調(diào)控作用。雖然D-半乳糖醛酸途徑已被廣泛證實(shí)，但整個(gè)路徑中的一些編碼酶基因以及該途徑調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

1.3 古洛糖酸途徑

Wolucka和Montagu[36]通過(guò)GDP-D-甘露糖-3’，5’-差向異構(gòu)酶(GME)的差向異構(gòu)反應(yīng)，提出了古洛糖途徑。該途徑開(kāi)始于GDP-L-古洛糖，經(jīng)若干酶促反應(yīng)最終生成Vc，但整個(gè)反應(yīng)途徑尚未被全面闡明，反應(yīng)途徑中的中間產(chǎn)物也未被充分克隆并分析。早期研究將在老鼠中克隆得到的L-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯氧化酶轉(zhuǎn)化進(jìn)萵苣和煙草可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株的Vc含量，基于此研究人員推測(cè)植物體內(nèi)可能存在一種替代途徑，它可能可以繞過(guò)L-半乳糖途徑中的一些步驟直接合成Vc，這一途徑可能與某些動(dòng)物Vc合成途徑相似[37-38]。Maruta等[39]對(duì)L-古洛糖-1,4-內(nèi)酯氧化酶(L-GulL)同系物AtGulLOs在Vc生物合成中的作用研究中發(fā)現(xiàn)，在L-GulL處理下轉(zhuǎn)基因煙草中總Vc含量與對(duì)照組相比顯著升高。Lim等[40]在番茄中過(guò)表達(dá)老鼠L-古洛糖-γ-內(nèi)酯氧化酶(GLOase)基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株Vc含量增加了1.5倍。這些研究都說(shuō)明該途徑可能參與植物體內(nèi)Vc的合成，而Lisko等[41]通過(guò)對(duì)擬南芥、馬鈴薯、煙草、番茄和水稻低Vc突變體進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)擬南芥過(guò)度表達(dá)含有高抗壞血酸的L-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯氧化酶，可促進(jìn)氣生和根組織生長(zhǎng)，同時(shí)Vc總含量明顯增加，這一研究證實(shí)了該途徑的存在。

1.4 肌醇途徑

Lorence等[42]在野生型擬南芥中超表達(dá)肌醇加氧酶(MIOX)，發(fā)現(xiàn)Vc含量明顯增加，基于此提出了一個(gè)可能的生物合成路徑-肌醇途徑。但Endres和Tenhaken[43]發(fā)現(xiàn)野生型和MIOX高表達(dá)擬南芥之間Vc生物合成沒(méi)有差異，因而推測(cè)MIOX對(duì)Vc的生物合成所起作用不大。Zhang等[44]從轉(zhuǎn)錄水平和酶活性兩個(gè)方面研究了缺氮條件下黃瓜幼苗抗Vc合成和循環(huán)途徑中的關(guān)鍵酶，發(fā)現(xiàn)缺氮誘導(dǎo)的基因參與了黃瓜葉片中Vc合成的肌醇途徑等，且MIOX可能在Vc的積累中起作用。因而該途徑的有效性尚未被充分證實(shí)，該途徑還需要更多的證據(jù)來(lái)支撐。雖然MIOX在Vc合成中的作用仍有待驗(yàn)證，但MIOX在提高植物抗逆性中的作用也引起了研究人員的興趣，或許肌醇途徑并不只參與Vc的合成。Chen等[45]利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)GsMIOX1a主要在花中表達(dá)，且GsMIOX1a基因正調(diào)節(jié)植物對(duì)堿脅迫的耐受性。

2 草莓Vc合成途徑內(nèi)關(guān)鍵基因

2.1 D-半乳糖醛酸途徑與GalUR

20世紀(jì)初Agius等[32]首次克隆了GalUR基因并證實(shí)了D-半乳糖醛酸途徑與GalUR的存在，由于當(dāng)時(shí)在草莓中尚未發(fā)現(xiàn)L-半乳糖途徑，所以研究人員認(rèn)為D-半乳糖醛酸途徑很有可能是草莓中Vc合成的主要途徑。但到目前為止該途徑僅有GalUR基因被克隆，且GalUR的作用機(jī)理還未被完全闡明。早期研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖醛酸途徑可能在成熟果實(shí)的Vc合成中起作用，Cruz-Rus等[46]研究發(fā)現(xiàn)不同品種草莓倍性與Vc含量均明顯不同，但Vc含量與倍性關(guān)系不大。同時(shí)對(duì)不同草莓品種GalUR的研究表明，GalUR與Vc含量的相關(guān)性在大多數(shù)情況下是明顯的。此外FaGalUR在草莓果實(shí)不同成熟期表達(dá)量顯著不同，這預(yù)示著在草莓果實(shí)不同發(fā)育階段調(diào)控Vc合成的途徑可能是不同的。草莓中D-半乳糖醛酸途徑的研究仍處在起步階段，該途徑中的各種中間產(chǎn)物也尚待發(fā)掘，GalUR在不用果實(shí)發(fā)育階段與不同倍性間的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步揭示。

目前D-半乳糖醛酸途徑的存在與否在草莓中得到了充足的證明，但該途徑在其他植物中是否發(fā)揮著同等重要的作用尚待進(jìn)一步研究。Lim等[47]將GalUR基因轉(zhuǎn)化番茄發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因番茄Vc含量明顯增加，同時(shí)轉(zhuǎn)基因植物后代由于Vc含量的增加也上調(diào)番茄的抗氧化系統(tǒng)，導(dǎo)致番茄對(duì)抗鹽等非生物脅迫的耐受性增強(qiáng)。Badejo等[48]研究發(fā)現(xiàn)在番茄綠色的果實(shí)中主要是L-半乳糖途徑調(diào)控其Vc的合成，而在成熟果實(shí)中D-半乳糖醛酸途徑則發(fā)揮著主導(dǎo)作用。這不僅說(shuō)明D-半乳糖醛酸途徑不僅在番茄果實(shí)Vc合成中發(fā)揮著重要作用，也說(shuō)明不同的植物器官或不同發(fā)育階段或許是不同的合成途徑參與Vc的積累。這一推測(cè)是否合理尚待證實(shí)，同時(shí)這也提醒我們?cè)诓葺~片與果實(shí)間甚至是果實(shí)不同成熟階段間，可能是不同合成途徑參與了Vc含量的積累。此外GalUR在草莓等植物抗逆性中發(fā)揮的作用亦不容忽視，這為今后的研究方向也提供了一定借鑒意義。

2.2 L-半乳糖途徑與VTC2

早期通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段提高植物Vc含量多在模式植物如擬南芥、煙草等植物的葉片中展開(kāi)，同時(shí)針對(duì)一些水果、農(nóng)作物如番茄、柑橘、馬鈴薯、獼猴桃的研究也在有序展開(kāi)，而草莓Vc合成途徑研究卻相對(duì)遲緩。L-半乳糖途徑是目前植物中Vc合成中最重要和最主要的路徑，而早期草莓中Vc合成途徑僅發(fā)現(xiàn)了D-半乳糖醛酸途徑。Bulley等[49]利用GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GGP/VTC2)轉(zhuǎn)化5個(gè)番茄系、9個(gè)馬鈴薯系和8個(gè)草莓系，發(fā)現(xiàn)所有草莓品系果和葉的Vc含量都增加了兩倍，這也似乎證實(shí)草莓葉與果實(shí)的Vc合成均有L-半乳糖途徑的參與。

目前研究發(fā)現(xiàn)VTC2在草莓Vc合成中占據(jù)重要地位，且該基因似乎是受光照調(diào)控的。Dowdle等[21]研究發(fā)現(xiàn)L-半乳糖途徑是擬南芥幼苗Vc的唯一重要來(lái)源，同時(shí)發(fā)現(xiàn)VTC2基因編碼的GDP-L-半乳糖磷酸化酶可將GDP-L-半乳糖轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-半乳糖1-P，并發(fā)現(xiàn)VTC2基因似乎與光照條件密切相關(guān)。Fukunaga等[50]研究發(fā)現(xiàn)水稻中Vc的合成受光的調(diào)控，且L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶(GPPase)、L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶(GalLDH)的啟動(dòng)子區(qū)域含有光順式元件。Qin等[27]發(fā)現(xiàn)GDP-甘露糖焦磷酸化酶(VTC1)的兩個(gè)同源基因OsVTC1-1和OsVTC1-3參與了Vc的合成，前者受光誘導(dǎo)表達(dá)，而后者受黑暗誘導(dǎo)表達(dá)。但因L-半乳糖途徑需要利用光合作用產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)而合成Vc，光照影響VTC2的表達(dá)，也極有可能是光照影響了植物自身的光合作用，L-半乳糖途徑Vc合成前體的減少，必然影響Vc的合成，因此VTC2在草莓中的光響應(yīng)機(jī)制及作用機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。

此外Baig等[51]給豆角和草莓澆灌L-古洛糖酸-1,4-內(nèi)酯，發(fā)現(xiàn)它們可將該化合物轉(zhuǎn)化為Vc，使Vc含量明顯提高。這似乎暗示草莓Vc合成途徑中可能存在古洛糖酸途徑，但迄今為止尚未有研究人員對(duì)此展開(kāi)研究，所以古洛糖酸途徑在草莓Vc合成中是否發(fā)揮著作用我們是不得而知的。但就目前而言，研究人員在草莓Vc合成中僅發(fā)現(xiàn)了D-半乳糖醛酸途徑和L-半乳糖途徑(圖2)。

圖2 草莓中Vc 生物合成途徑

3 展望

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于草莓Vc合成調(diào)控機(jī)制的研究明顯落后于擬南芥、煙草、水稻等模式植物，甚至柑橘、番茄、獼猴桃等農(nóng)作物或水果的研究也明顯領(lǐng)先于草莓。最早在草莓中鑒定的D-半乳糖醛酸途徑也僅有GalUR被克隆，該途徑的具體機(jī)制尚未完全明確，甚至GalUR的作用機(jī)制也未被完全闡明。目前研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖醛酸途徑可能在果實(shí)發(fā)育中起作用，然而在草莓不同倍性、果實(shí)不同發(fā)育階段以及草莓葉片和果實(shí)中，究竟哪種途徑占據(jù)主導(dǎo)地位，或是它們間是否存在不同的調(diào)控機(jī)制，這些都值得進(jìn)行深入研究。

在草莓中鑒定出了D-甘露糖途徑，然而卻少有研究者對(duì)此展開(kāi)探索與討論。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)D-甘露糖途徑主要在植物葉片及青果期發(fā)揮作用，然而該途徑是否在草莓葉片及草莓青果期中占主導(dǎo)地位還值得深入研究。同時(shí)VTC2在草莓Vc合成中占的重要地位也逐漸被發(fā)掘，尤其是該基因受光調(diào)控現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，也為該路徑與該基因的研究提供了新思路。此外GalUR與VTC2可調(diào)控Vc合成而在提高植物抗逆性方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)越性，隨著現(xiàn)代分子育種技術(shù)的興起，利用優(yōu)異基因提高水果、作物營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及抗逆性具有重要意義。但目前對(duì)這兩種酶的研究尚不深入，尤其是遺傳方面的研究還比較少，調(diào)控其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子方面研究也存在著一定缺失。