周美雙, 李瓊霞, 付云芝

(海南大學(xué)理學(xué)院, ?？?570228)

由于三聚氰胺(Melamine, Mel)中氮含量高達(dá)66.6%且其性質(zhì)類似于蛋白質(zhì),故常被非法添加至奶粉乳制品、飼料或其他食品中[1]．長(zhǎng)期或過(guò)量攝入Mel不僅會(huì)損害人類腎臟、生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等,而且可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌[2]．2017年, Mel被報(bào)道可能為內(nèi)分泌干擾物和神經(jīng)毒物[3-4]．目前, 檢測(cè)Mel的方法主要有電化學(xué)法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6]、高效液相色譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]和拉曼光譜法[9]等,上述方法大多須借助大型儀器設(shè)備且費(fèi)用較高, 人力、物力資源消耗多．通過(guò)比色法和紫外光譜分析[10]檢測(cè)Mel則具有操作簡(jiǎn)單、成本低和耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn), 現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)．AuNPs因具有局域表面等離子體共振特性以及獨(dú)特的尺寸和粒子間距離相關(guān)的光學(xué)性能, 可被廣泛用于Mel的比色分析[10-11]．本文擬通過(guò)具有保護(hù)能力的海草提取液直接生物還原氯金酸來(lái)綠色制備AuNPs溶膠, 并采用比色法和紫外-可見吸收光譜分析檢測(cè)Mel．

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

氯金酸(HAuCl4)、抗壞血酸、尿素、谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和無(wú)水碳酸鈉均購(gòu)自中國(guó)國(guó)藥集團(tuán); Mel單體購(gòu)自上海梯希愛(TCI)仁成工業(yè)發(fā)展有限公司,無(wú)水氯化鈣、氯化鈉、氫氧化鈉、乙腈和無(wú)水乙醇購(gòu)自西隴有限公司; 硫酸銨、活性炭粉、氯化鉀和葡萄糖購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠;三氯乙酸和乳糖購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;上述試劑均為分析純．海草購(gòu)買于海南省海口市東門市場(chǎng); 水為超純水．

UV-2500紫外-可見分光光度儀(島津公司,日本); TENSOR 27傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)儀(布魯克公司, 德國(guó));ESCALAB 250Xi X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy, XPS)儀(賽默飛世爾科技公司, 美國(guó)); JEM-2100透射電子顯微鏡(transmission electron microscopy, TEM)(電子株式會(huì)社, 日本)．

1.2 海草提取液的制備

將2.0 g洗凈曬干粉碎后的海草加入80 mL無(wú)水乙醇中, 混合后于80 ℃下磁力攪拌1 h, 提取液冷卻至25 ℃后抽濾, 加入適量活性炭粉靜置24 h脫色,抽濾去除活性炭粉, 將濾液離心,加水稀釋10倍后得海草提取液, 置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫胁Ａx器均用王水(V(濃硝酸)∶V(濃鹽酸)=1∶3) 洗滌．

1.3 AuNPs溶膠的制備

取海草提取液1.00 mL, 調(diào)節(jié)其pH至12.12, 向其中加入5 mL 1 mmol·L-1氯金酸溶液, 設(shè)定反應(yīng)溫度為50 ℃, 于水浴鍋中磁力攪拌30 min,得酒紅色AuNPs溶膠．分別討論反應(yīng)溫度、海草提取液用量及提取液初始pH值等3個(gè)因素對(duì)制備AuNPs溶膠的影響, 固定其中2個(gè)變量, 將另一變量設(shè)定一個(gè)梯度,探究最優(yōu)反應(yīng)條件．設(shè)計(jì)溫度變量的梯度為25,40,50,60,70,80 ℃; 提取液用量的梯度為1.00,2.00,3.00,4.00,5.00,6.00 mL;提取液初始pH的梯度為11.72, 11.90, 12.12, 12.23, 12.33, 12.42．

1.4 AuNPs溶膠及與Mel混合反應(yīng)后溶液(Mel-AuNPs)的紫外-可見光譜測(cè)定

取2.00 mL最優(yōu)反應(yīng)條件下所制備出的酒紅色AuNPs溶膠, 向其中加入3.00 mL濃度為0.6 μmoL·L-1的Mel溶液, 于25 ℃下混合反應(yīng)10 min后進(jìn)行紫外-可見吸收光譜測(cè)定．

1.5 Mel的可視化檢測(cè)

準(zhǔn)確稱取0.100 0 g Mel單體粉末標(biāo)準(zhǔn)品于25 mL燒杯中, 加水溶解并定容至100 mL, 得到1.0 g·L-1Mel儲(chǔ)備液．將其配制成濃度分別為0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0 μmoL·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液．將3 mL上述不同濃度的Mel標(biāo)準(zhǔn)溶液加入2 mL酒紅色AuNPs溶膠中, 于25 ℃下混合反應(yīng)10 min, 觀察混合液顏色變化并進(jìn)行紫外-可見吸收光譜測(cè)定．

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

1) 反應(yīng)溫度．固定海草提取液用量為1.00 mL和初始pH為12.12, 不同反應(yīng)溫度時(shí)所得AuNPs溶膠的紫外-可見吸收光譜如圖1(a)所示．由圖1(a)可見: 隨著溫度的升高,所制備AuNPs溶膠的顏色由淺灰色變?yōu)闇\紫色、最終變?yōu)榫萍t色, AuNPs溶膠的紫外最大吸收峰強(qiáng)度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì),紫外最大吸收峰位置和峰寬在50 ℃后基本保持不變; 當(dāng)反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí), 生成AuNPs數(shù)量最多且粒徑分布較均勻;反應(yīng)溫度超過(guò)50 ℃后對(duì)所制備AuNPs的粒徑分布影響較小, 但會(huì)影響AuNPs成核數(shù)量．根據(jù)能斯特方程, 溫度是影響海草提取液中有效還原物質(zhì)還原電位的因素之一, 低溫不利于還原物質(zhì)還原電位的下降, 從而不利于對(duì)氯金酸的還原成核．鑒于實(shí)驗(yàn)選擇最節(jié)能的反應(yīng)條件,將后續(xù)的反應(yīng)溫度設(shè)定為50 ℃．

2) 海草提取液用量．固定反應(yīng)溫度為50 ℃和海草提取液初始pH為12.12, 不同提取液用量下所得AuNPs溶膠的紫外-可見吸收光譜如圖1(b)所示．由圖1(b)可見: 隨提取液用量的增加, 所制備AuNPs溶膠的顏色無(wú)明顯變化, 均為酒紅色; 當(dāng)海草提取液用量由1.00 mL逐漸增至6.00 mL時(shí), 紫外最大吸收峰的峰位逐漸紅移,相應(yīng)的強(qiáng)度逐漸降低．根據(jù)吸收峰位置和半峰寬,可以判定當(dāng)提取液用量為1.00 mL時(shí)生成的AuNPs粒徑最小, 分布最好．其原因是植物提取液用量越大,體系中的海藻酸越多,海藻酸間的羧基可能失水交聯(lián),增強(qiáng)了液體的黏度,從而阻礙Au3+的運(yùn)動(dòng), 使得Au3+被錨定在海藻酸某個(gè)部位成核并長(zhǎng)大,所以生成的納米顆粒得不到保護(hù),容易形成較大顆粒．

2.2 AuNPs溶膠及與Mel反應(yīng)后溶液(Mel-AuNPs)的UV-Vis分析

圖2給出了AuNPs和Mel-AuNPs的紫外-可見吸收光譜圖, 且在圖中顯示了AuNPs和Mel-AuNPs的顏色．由圖2可知, 加入Mel標(biāo)準(zhǔn)液后的AuNPs溶膠由酒紅色變?yōu)樗{(lán)灰色, 最大紫外吸收峰的峰值與峰形均出現(xiàn)明顯變化, 表明Mel的加入會(huì)引發(fā)AuNPs顆粒聚集, 從而導(dǎo)致溶液顏色變化及紫外吸收的顯著不同．由此可知該AuNPs溶膠對(duì)Mel有響應(yīng), 可應(yīng)用于Mel的可視化檢測(cè)．

2.3 FTIR分析

圖3為海草提取液、AuNPs及Mel-AuNPs等3個(gè)樣品的紅外分析光譜圖．由圖3可見: 1) 海草提取液的紅外光譜中, 在3 386 cm-1和3 163 cm-1處有2個(gè)較強(qiáng)的吸收峰是O—H引起的伸縮振動(dòng), 表明羥基的存在; 1 640 cm-1和1 402 cm-1處出現(xiàn)的尖峰可歸屬于C=O伸縮振動(dòng), 這可能是由于羧酸的存在所致; 1 205 cm-1和1 044 cm-1處的峰歸因于C—O或C—O—C的拉伸振動(dòng); 海草提取液中存在羥基、羧基等都有助于AuNPs的形成; 2) 在AuNPs的FTIR中, 3 425 cm-1處的吸收峰歸因于O—H的伸縮振動(dòng); 1 578, 1 420 cm-1處2個(gè)峰可歸因于—COO的反對(duì)稱和對(duì)稱拉伸振動(dòng), 可能來(lái)自羧酸鹽; 1 044, 1 014 cm-1處的吸收峰是由于C—O—C的拉伸振動(dòng); 3) 在Mel-AuNPs的紅外光譜中, 3 469, 3 419, 3 335, 3 134 cm-1處的4個(gè)尖峰均為Mel的—NH2伸縮振動(dòng); 1 654 cm-1為Mel中N—H彎曲振動(dòng); 1 555, 1 469, 1 440 cm-1處3個(gè)吸收峰都在Mel的另一光譜特征區(qū)域1 400～1 600 cm-1范圍內(nèi), 歸因于Mel中1,3,5-三嗪環(huán)的C=N伸縮振動(dòng); 在1 030 cm-1和815 cm-1處的峰對(duì)應(yīng)于Mel中三嗪環(huán)中的C—N伸縮振動(dòng)[12]．此外, 在 3 134 cm-1和1 198 cm-1處出現(xiàn)2個(gè)吸收峰可能預(yù)示Mel和AuNPs溶膠的結(jié)合[13]．

2.4 XPS分析

對(duì)AuNPs和Mel-AuNPs樣品進(jìn)行XPS研究以獲得樣品的表面元素組成, 結(jié)果如圖4所示．由圖4可見 :1) 在Mel-AuNPs的元素掃描譜圖中出現(xiàn)明顯的氮信號(hào), 表明有Mel被AuNPs吸附在表面; 2) Mel-AuNPs的N 1s光譜顯示在398.16 eV和399.05 eV有2個(gè)分離良好的峰, 分別屬于—N=C和—NH2, 其峰豐度大小與Mel的N 1s特征XPS峰一致[14]; 3) 2個(gè)樣品Au 4f光譜譜圖中的Au峰位并未見明顯位移, 均可分配給Au0; 4) AuNPs和Mel-AuNPs的C 1s的信號(hào)峰位極為相似, 均可被分解為兩個(gè)清晰可辨的峰, 表明存在不同類型的碳鍵: 284.8 eV(AuNPs)和284.9 eV(Mel-AuNPs)處的峰可歸因于C—C、C—O、C—O—C; 288.2 eV處的峰屬于羰基碳(—C=O)[15], 這些結(jié)果與FTIR分析中證實(shí)的AuNPs表面含有羧基相一致; 5) 2個(gè)樣品的O 1s峰存在較小差異, AuNPs存在531.1 eV和535.8 eV兩個(gè)分離峰,前者與—C—O—C、—OH、—COOH的存在相關(guān), 后者可歸因于羰基碳(—C=O); Mel-AuNPs的分析結(jié)果中顯示出531.3 eV和534.9 eV兩個(gè)分離峰, 這表明在Mel-AuNPs表面有羧酸分子保留．

2.5 TEM分析

圖5為AuNPs和Mel-AuNPs的TEM圖．由圖5可知, AuNPs的粒徑約為8～11 nm, 且呈現(xiàn)單分散狀態(tài),當(dāng)加入Mel標(biāo)準(zhǔn)液后顆粒呈聚集狀態(tài)．這是由于AuNPs具有局域表面等離子體共振特性和其光學(xué)特性, 當(dāng)Mel加入后AuNPs會(huì)發(fā)生聚集．保護(hù)在AuNPs表面的分子以海藻酸居多,作為橋梁分子的Mel的加入,使得氨基與羧基發(fā)生失水縮合作用,促使AuNPs間的聚集．

2.6 Mel的可視化檢測(cè)

圖6為與不同濃度Mel標(biāo)準(zhǔn)液混合后的AuNPs的紫外-可見吸收光譜圖．由圖6可見: 隨Mel濃度的增加, 紫外吸收峰形狀和峰值逐漸變化, 且AuNPs溶膠顏色由酒紅色變?yōu)樽仙? 最終變?yōu)樗{(lán)黑色, 表明AuNPs溶膠由分散態(tài)向聚集態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變．這是由于Mel中的氨基與羧基發(fā)生失水縮合作用,造成AuNPs間的聚集．當(dāng)Mel含量越高時(shí),體系中氨基的含量越多,失水縮合程度加劇,從而加劇顆粒的聚集程度．當(dāng)AuNPs溶膠中所含有Mel標(biāo)準(zhǔn)液的濃度足夠大時(shí), 該體系不穩(wěn)定, 待一段時(shí)間后會(huì)產(chǎn)生聚沉,上層液呈無(wú)色透明狀．

圖7為Mel標(biāo)準(zhǔn)液物質(zhì)的量濃度與吸光度比值A(chǔ)650/A520關(guān)系曲線．如圖7可知, 當(dāng)Mel標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0.4～0.8 μmol·L-1時(shí), Mel-AuNPs在波長(zhǎng)為650 nm和520 nm下的吸光度比值A(chǔ)650/A520與Mel標(biāo)準(zhǔn)液濃度存在正相關(guān)關(guān)系,標(biāo)準(zhǔn)曲線可表示為A650/A520=3.211 15c(Mel)-1.049 17(R2=0.989), 檢出限為0.359 μmol·L-1, 遠(yuǎn)低于美國(guó)FDA和歐盟規(guī)定的牛奶中三聚氰胺的最大殘留標(biāo)準(zhǔn)2.5 mg·L-1(即20 μmol·L-1)．

2.7 抗干擾實(shí)驗(yàn)

現(xiàn)配制濃度均為Mel標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度100倍的各物質(zhì)溶液, 即濃度均為60 μmol·L-1的NaCl、KCl、CaCl2、(NH4)2SO4、抗壞血酸、尿素、谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、葡萄糖、乳糖溶液加入酒紅色的AuNPs溶膠中進(jìn)行抗干擾實(shí)驗(yàn), 結(jié)果如圖8所示．由圖8可知,與加入濃度為0.6 μmol·L-1Mel標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品(編號(hào)18)相比,其他樣品在紫外光譜吸收和顏色上均無(wú)明顯差異; Mel的吸光度比值(A650/A520) 明顯高于其他干擾因素的, 表明即使大量存在其他因素也不會(huì)影響AuNPs溶膠對(duì)Mel的檢測(cè), 體系對(duì)Mel的檢測(cè)存在特異性．

3 結(jié)論

本文以海草提取液為環(huán)境成功制備顆粒較小且分布均勻的酒紅色AuNPs溶膠, 利用紫外-可見吸收光譜法實(shí)現(xiàn)了對(duì)Mel簡(jiǎn)單、快速、低成本及可視化檢測(cè)．基于Mel可引起AuNPs之間的聚集, 從而使AuNPs溶膠顏色及其紫外-可見吸收光譜均發(fā)生變化, 對(duì)Mel進(jìn)行檢測(cè)．結(jié)果表明, 當(dāng)Mel標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0.4～0.8 μmol·L-1范圍內(nèi)存在良好的線性關(guān)系, 最低檢測(cè)限為0.359 μmol·L-1．通過(guò)抗干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本文方法的選擇性較好, 在檢測(cè)非法添加Mel方面具有很好的應(yīng)用前景．