曾媛 盧孝清 張妮 夏名英

非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是一種常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，包括肺鱗癌、肺腺癌和大細胞癌[1],占肺癌患者的75%～85%，患者死亡率高達89%，居所有類型惡性腫瘤首位[1]。近年來隨著放化療、生物治療、分子靶向治療等治療手段進步，NSCLC患者預后有所改善[2]，但死亡率仍處于較高水平，因此積極探究NSCLC進展、預后相關影響因子對腫瘤臨床治療仍有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn)，間質表皮轉化因子(Mesenchymal to epithelial transition factor，MET)在膽管癌組織中陽性表達率明顯升高，與膽管癌分期和淋巴結轉移有關[3]。王瑾等研究表明，甲狀腺惡性結節(jié)組織中MET表達上調，聯(lián)合超聲檢測對評估甲狀腺癌患者淋巴結轉移及預后價值較高[4]。有研究報道，結直腸癌患者外周血血栓素A2(Thromboxane A2，TXA2)水平升高，可能在促進腫瘤細胞增殖、轉移中有重要作用[5]。Li等研究證實，TXA2在人乳腺癌腫瘤及癌前病變中均有高表達，可能是調控乳腺癌細胞生長和侵襲能力的關鍵因子[6]。本研究通過檢測NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA及蛋白表達水平，分析與患者臨床病理特征及預后關系，探究二者在NSCLC進展中作用，為臨床患者病情及預后判斷提供一定理論依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

選取2009年6月～2014年6月本院收治的NSCLC患者82例作為研究對象，其中男性47例、女性35例，年齡(41～73)歲，平均(52.31±15.04)歲。納入標準：①根據(jù)病理切片及TNM分期診斷標準[7]，確診為非小細胞肺癌。②臨床及隨訪資料完整。③患者及家屬均對本研究知情，并簽署知情同意書。④入組前未接受放、化療等治療。排除標準：①合并其他部位腫瘤。②心、腎、肝臟等重要器官嚴重功能障礙。③患有嚴重精神疾病。④孕期、哺乳期婦女。入組患者根據(jù)腫瘤分化程度分為：高中分化36例、低分化46例；根據(jù)病理類型分為：鱗癌39例、腺癌43例；根據(jù)原發(fā)腫瘤大小分為：T1～T2期64例、T3～T4期18例；根據(jù)TN分期標準可分為：Ⅰ～Ⅱ期60例、Ⅲ期22例；根據(jù)淋巴結轉移情況分為：無淋巴結轉移57例，有淋巴結轉移25例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準同意。

二、主要儀器和試劑

熒光定量PCR儀(型號：SLAN-965，上海宏石醫(yī)療有限公司)，RNA提取試劑盒(貨號：RP2402，北京百泰克生物技術有限公司)，反轉錄試劑盒(貨號：205311，德國Qiagen公司)，熒光定量PCR試劑盒(貨號：RR820A，大連寶日醫(yī)生物技術有限公司)，免疫組織化學染色試劑盒(貨號：ab7310，上海艾博抗貿易有限公司)，兔抗人MET多克隆抗體(貨號：ab137654，上海艾博抗貿易有限公司)羊抗兔IgG二抗(貨號：A21220，深圳市安提生物科技有限公司)。

三、方法

1 樣本采集

術中收集NSCLC患者癌組織及癌旁組織(距病灶>5cm)，一部分使用10%福爾馬林浸泡后制成4μm厚切片，用于免疫組織化學染色；另一部分在液氮中冷凍后放入-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR實驗。

2 組織中MET、TXA2 mRNA表達水平檢測

采用qRT-PCR法檢測NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA表達水平。采用Trizol法提取RNA，反轉錄后得到cDNA樣本，使用qRT-PCR試劑盒配制20μL反應體系進行實驗，反應程序如下:95℃，5min，1循環(huán)；95℃、20s，62℃、36s，70℃、20s，以上40循環(huán)，一個樣品進行三次重復。采用2-ΔΔCT法計算MET、TXA2 mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物

3 組織中MET、TXA2蛋白表達水平檢測

采用免疫組織化學染色法檢測NSCLC組織中MET、TXA2蛋白表達水平。嚴格按照試劑盒說明書進行操作。所得切片在400倍顯微鏡下觀察并采集圖像資料。染色結果評分標準：細胞核、細胞質中呈棕黃色或棕褐色為MET、TXA2蛋白陽性細胞。按照陽性細胞百分比和染色強度評分：①陽性細胞百分比：<5%記0分，5%～25%記1分，>25%～50%記2分，>50%～75%記3分，>75%記4分。②陽性著色強度：無色記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。兩者記分相乘為染色指數(shù)，根據(jù)染色指數(shù)分級：0～4分為低表達；5～12分為高表達。

四、隨訪

所有入組患者經(jīng)治療出院后以電話或復查形式對其進行5年隨訪，每3個月1次，期間觀察并記錄患者生存情況，隨訪至2019年6月截止，隨訪期間無失訪患者。

五、統(tǒng)計學分析

結 果

一、NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2 mRNA表達水平比較

NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)(見表2)。

表2 NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2 mRNA表達水平比較

二、NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2蛋白表達水平比較

如圖1所示，MET、TXA2蛋白主要表達于細胞質中。NSCLC組織中MET、TXA2蛋白高表達率明顯高于癌旁組織(P<0.05)(見表3)。

圖1 NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2蛋白表達水平比較

表3 NSCLC組織及癌旁組織中MET、TXA2蛋白表達水平比較

三、NSCLC組織中MET、TXA2蛋白表達與患者臨床特征關系

NSCLC組織MET、TXA2蛋白表達水平與患者性別、年齡及吸煙與否、腫瘤病理類型比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤大小、TN分期、淋巴結轉移比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表4)。

表4 NSCLC組織中MET、TXA2蛋白表達與患者臨床特征關系

四、NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA表達水平相關性

NSCLC組織中MET mRNA與TXA2 mRNA表達水平呈正相關(rs=0.413，P<0.001)(見圖2)。

圖2 NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA表達水平相關性

五、MET、TXA2表達水平與NSCLC患者預后關系

經(jīng)Kaplan-Meier生存分析可知，MET高表達組患者5年累積生存19例，5年總生存率為37.36%；MET低表達組患者5年累積生存22例，5年總生存率為70.97%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.169，P<0.05)。TXA2高表達組患者5年累積生存18例，5年總生存率為33.33%；TXA2低表達組患者5年累計生存23例，5年總生存率為82.14%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.980，P<0.05)(見圖3)。

圖3 MET、TXA2表達水平與NSCLC患者預后關系

六、COX回歸分析

單因素分析顯示，MET、TXA2表達水平、腫瘤浸潤深度、TNM分期、有無淋巴結轉移、腫瘤分化程度均是影響NSCLC患者預后的危險因素。多因素分析顯示，MET、TXA2表達水平和腫瘤分化程度是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素(見表5)。

表5 影響NSCLC患者預后的危險因素分析結果

討 論

近年來，NSCLC發(fā)病率較高，且患者癥狀不具有典型特征，早期難以被確診，病情易進展至中晚期，出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、咳血、轉移至其它器官引起病變，嚴重威脅患者生存及生活質量[8]。尋找特異性標志物是控制NSCLC病情進展、提高患者生存率關鍵。

MET位于人類第7條染色體7q21-q31區(qū)域，主要表達于肺、肝、腎、支氣管、胰腺等器官上皮細胞中，可與配體肝細胞生長因子(Hepatocyte growth factor，HGF)相互作用，激活磷脂酰肌醇激酶、絲裂原活化蛋白激酶等信號通路，參與調控細胞有絲分裂等生長過程[9]。Cho等研究證實，MET在小細胞肺癌中過表達，可促進癌細胞生長、侵襲和凋亡[10]。本研究結果顯示，NSCLC組織中MET蛋白及mRNA表達水平明顯高于癌旁組織，與Cho等[10]在小細胞肺癌中研究結果相似，提示MET表達水平升高可能與NSCLC發(fā)生有關。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，MET過表達與乳腺癌腫瘤體積大、腫瘤高分化、淋巴結轉移有關[11]。本研究結果顯示，NSCLC組織MET蛋白表達水平與患者性別、年齡及吸煙與否、腫瘤病理類型比較，差異無統(tǒng)計學意義；與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤大小、TN分期、淋巴結轉移比較，差異有統(tǒng)計學意義。

TXA2是由血小板、血管內皮細胞、中性粒細胞、星形膠質細胞等在一定條件下分泌，具有刺激血管平滑肌細胞增殖和遷移作用[12]。本研究結果顯示，與癌旁組織相比，NSCLC組織中TXA2表達水平明顯升高，提示TXA2水平上調可能與NSCLC發(fā)生有關。研究報道，TXA2在前列腺癌中高表達，可通過調控癌細胞染色體重構和雄激素活性，促進癌細胞增殖、侵襲和遷移[13]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，NSCLC組織TXA2蛋白表達水平與患者性別、年齡及吸煙與否、腫瘤病理類型比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤大小、TN分期、淋巴結轉移比較，差異有統(tǒng)計學意義，提示TXA2蛋白表達水平上調可能通過影響癌細胞增殖、侵襲、遷移水平，參與NSCLC發(fā)展。

NSCLC組織中MET與TXA2 mRNA表達水平呈正相關，提示MET和TXA2間可能存在相互作用機制，共同促進NSCLC發(fā)生發(fā)展，但具體機制尚需進一步研究。Karolina等人研究發(fā)現(xiàn)，血小板增多可通過分泌TXA2促進卵巢癌進展和不良預后發(fā)生[14]。Kim等研究表明，胃腫瘤原發(fā)灶和肝轉移灶中MET均過表達，與患者總生存期較短、復發(fā)率增加有關，是患者不良預后標志物[15]。本研究結果顯示，MET、TXA2高表達組5年總生存率明顯低于MET、TXA2低表達組，提示MET、TXA2高表達可能與NSCLC生存率低等不良預后有關。單因素分析顯示，MET、TXA2表達水平、腫瘤浸潤深度、TNM分期、有無淋巴結轉移、腫瘤分化程度均是影響NSCLC患者預后的危險因素。多因素分析顯示，MET、TXA2表達水平和腫瘤分化程度是影響NSCLC患者預后的獨立危險因素。提示MET、TXA2與NSCLC患者預后關系密切，可作為NSCLC患者預后的評估指標。

綜上所述，與癌旁組織相比，NSCLC組織中MET、TXA2 mRNA及蛋白表達水平明顯升高，可能與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤大小、TN分期、淋巴結轉移有關，二者相互作用，共同參與NSCLC發(fā)生、發(fā)展過程。但由于本研究樣本量較少，研究方法較為單一，具體研究機制還需進一步進行實驗驗證探究。