謝景臣 謝五菊 王成存

近年來，非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)發(fā)病率迅速增加[1]。盡管在診斷和治療方面取得了進展，但NSCLC患者易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，如能早期治療，患者5年生存率可達50%[2-4]。目前，臨床診斷標志物是CEA，CYFRA21-1和SCC[5]。然而，這些腫瘤標志物往往不能提高早期診斷率。因此，尋找新的NSCLC標記物成為迫切的任務(wù)。微小RNA(miRNA)是一組內(nèi)源性小和非編碼RNA[6]，且在發(fā)育，分化，增殖和凋亡起著重要作用[7]。研究表明，miR-325-3p上調(diào)通過靶向HMGB1在NSCLC中抑制細胞侵襲和增殖[9-10]。此外，miRNA亦可作為腫瘤抑癌基因，并作為腫瘤啟動子[11-12]。 然而，miR411在NSCLC中表達及其臨床意義的研究較少。本研究通過探討miR-411在非小細胞肺癌(NSCLC)組織中的表達及其表達與NSCLC臨床病例特征和預(yù)后的關(guān)系，以期為NSCLC的診斷和治療尋找新的分子靶點。

資料與方法

一、 一般資料

收集2017年3月至2018年8月于海南西部中心醫(yī)院普二科行肺癌根治手術(shù)切除的非小細胞肺癌組織62例及其相應(yīng)的癌旁組織。將人體組織在液氮中冷卻并立即在-80℃冰箱中存儲。所有患者均簽署知情同意書及我院倫理委員會批準。

二、 實驗儀器和試劑

實時熒光定量PCR(qPCR)儀，購于美國BioRad公司，Trizol Reagent購自于美國Invitrogen公司，總RNA提取試劑盒購自北京天根生化有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Fermentas公司，SYBR Premix Ex Tap試劑盒購自日本TaKaRa公司，miR-411和內(nèi)參β-actin引物均有上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成。

三、實時熒光定量PCR檢測miR-411相對表達量

從-80℃冰箱中取出預(yù)先保存的NSCLC樣品及非腫瘤樣品組織，Trizol法提取總RNA，用酶標儀測定RNA濃度和純度，其中RNA純度在19.～2.1之間。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，按照20 μl的反應(yīng)體系進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。miR-411和內(nèi)參β-actin cDNA實時熒光定量PCR反應(yīng)體系均為10 μl，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變形5 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。以 2-△△Ct表示目的基因相對表達量。具體引物序列(見表1)。

表1 引物序列信息

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行處理數(shù)據(jù)，計量資料采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗(獨立樣本t檢驗)，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較，方差齊性采用LSD法，方差不齊采用Games-Howell法，采用Graph Pad軟件用于顯示表達的分布情況，Cox回歸模型分析影響總生存的因素。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 miR-411表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

miR-411的表達與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；與年齡、性別、腫瘤直徑、組織學(xué)和有無吸煙史無關(guān)(P>0.05)(見表2)。

表2 miR-411表達與NSCLC臨床病理特別的關(guān)系

二、非小細胞肺癌組織中miR-411表達

qPCR法檢測miR411結(jié)果顯示，非小細胞肺癌組織中miR-411表達水平為5.58±0.52，顯著高于癌旁組織的1.64±0.38，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見圖1)。

圖1 NSCLC組織和癌旁組織中miR411的表達情況

三、非小細胞肺癌預(yù)后分析

不同性別、年齡、有無吸煙史、腫瘤直徑和組織學(xué)類型間非小細胞肺癌患者的OS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而不同TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移否患者間的miR-411表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。

表3 NSCLC組織中不同臨床病理參數(shù)的中位OS

四、影響NSCLC患者預(yù)后COX多因素分析

采用COX回歸模型分析，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=1.698，95%CI：1.021～3.998)，TNM分期(HR=2.394，95%CI：1.289～4.221)及miR411(HR=1.447，95%CI：1.087～3.648)是影響預(yù)后的影響因素(P< 0.05)(見表4)。

表4 多因素COX回歸模型分析

討 論

腫瘤的發(fā)展是一個多階段的緩慢過程，涉及廣泛的分子生物學(xué)變化[13]。目前，已發(fā)現(xiàn)越來越多的腫瘤標志物在患者的組織中異常表達。早期研究報道表明，一些標志物可用于診斷和預(yù)測NSCLC的潛在生物標志物，如血清蛋白酶激活受體1[14]，糖基化α-1-酸性糖蛋白1[15]和血清HE4[16]。由于循環(huán)miRNA在2008年被發(fā)現(xiàn)[17]，它們迅速成為人類癌癥診斷和預(yù)后的熱點[18]。據(jù)報道，一些組織miRNA是腫瘤的潛在診斷和預(yù)后的生物標志物，例如宮頸癌的組織miR-20523[19]，肝細胞癌的組織miR-224[20]和骨肉瘤的組織miR-497[21]。

MiR-411在14q32編碼并且屬于14q32.31miR簇B[22]。以前的研究報道m(xù)iR-411可能在腫瘤發(fā)生中起正或負作用。例如，Guo等[23]報道m(xù)iR-411在乳腺癌中顯著下調(diào)，miR411的過表達通過靶向特異性蛋白1顯著抑制乳腺癌細胞的生長，遷移和侵襲。Xia等[24]發(fā)現(xiàn)異位表達 miR-411通過靶向ITCH表達促進人肝細胞癌細胞的增殖。上述結(jié)果表明miR-411在肝細胞癌和乳腺癌中起腫瘤抑制劑的作用。最近，Nadal等[22]報道m(xù)iR-411表達在肺癌中顯著上調(diào)。通過生存分析，他們發(fā)現(xiàn)具有較高miR-411表達水平的患者與較差的總體存活相關(guān)。此外，Zhao等[12]的另一項研究表明，miR411的過表達通過靶向腫瘤抑制基因FOXO1促進肺癌的細胞增殖。這些結(jié)果表明miR-411在NSCLC中充當腫瘤啟動子。然而，迄今為止，盡管已報道了miR411的預(yù)后價值，但尚未報道NSCLC組織中miR-411的表達及早期診斷意義。在本研究中，我們利用RT-PCR法檢測了NSCLC患者組織中miR-411的mRNA相對表達水平。我們的結(jié)果顯示，NSCLC患者的組織miR411水平顯著高于癌旁組織。接下來,我們分析了組織中miR-411表達與各種臨床病理因素之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)組織中miR-411的表達與TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。提示組織中miR-411表達者與NSCLC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，miR-411高表達者可能與TNM分期較晚和伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在預(yù)后方面，將miR-411表達≤3.21定義為低表達，>3.21定義為高表達。miR-411高表達者的中位OS>28個月，顯著高于低表達者的22個月，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。另外Cox單因素分析顯示除miR-411表達外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期也與OS有關(guān)(P<0.05)。提示miR-411高表達、分期晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的OS差。研究顯示miRNA和肺癌臨床病理特征和預(yù)后有關(guān)，Wang等研究發(fā)現(xiàn)，miR-411與NSCLC的臨床分期、病理分型有關(guān)[25]。此外，目前臨床上關(guān)于miR-411和NSCLC的關(guān)系的研究少有報道，本研究結(jié)果表明miR-411的高表達可作為NSCLC的診斷，為后期預(yù)后預(yù)測提供新思路。

綜上所述，miR-411在NSCLC中呈現(xiàn)高表達可作為診斷惡性程度預(yù)測的重要分子標志物，并且可作為后期深入研究的治療NSCLC新靶點。