蘇琦

(焦作市疾病預(yù)防控制中心 結(jié)防科， 河南 焦作 454150)

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculoaus mycobacteria，NTM)與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(M.tuberculosis-complex，MTC)感染的治療方式完全不同，故鑒定NTM與MTC對(duì)指導(dǎo)治療具有重要意義。我國(guó)于2016年出版的相關(guān)專家共識(shí)指出，NTM目前已超過170種，其中約1/3與人類感染性疾病有關(guān)[1]?？梢婅b定不同類型的NTM對(duì)擬定治療方案同樣重要?？顾崛旧菍?shí)驗(yàn)室診斷分枝桿菌的常用方式，但抗酸染色容易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，且鑒定NTM與MTC易受到其他細(xì)菌的干擾[2-3]。雙重引物聚合酶鏈反應(yīng)(duplex polymerase chain reaction，Duplex-PCR)是鑒定NTM與MTC的金標(biāo)準(zhǔn)，但Duplex-PCR耗費(fèi)高、操作復(fù)雜、對(duì)技術(shù)人員要求高，且對(duì)于不同類型NTM的PCR測(cè)序引物也缺少統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[4]。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)是一類簡(jiǎn)單、快捷的微生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，在分枝桿菌以外的多種細(xì)菌鑒定中已得到充分應(yīng)用?；诖?，本研究分析MALDI-TOF MS在NTM鑒定及分型中的應(yīng)用價(jià)值，旨在為分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室診斷提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2017年1月至2019年4月焦作市疾病預(yù)防控制中心結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)與抗酸染色陽性的菌株資料，排除重復(fù)菌株(取自相同時(shí)間、相同患者)后，以剩余的98株菌株作為研究對(duì)象。來源：痰液48株，肺泡灌洗液20株，胸腹水8株，腦脊液7株，膿液7株，關(guān)節(jié)液3株，尿液3株，病理組織2株。

1.2 檢測(cè)方法(1)MALDI-TOF MS：對(duì)菌株行常規(guī)生物滅活，水浴加熱分枝桿菌培養(yǎng)管30 min，離心處理后去除上清液、留取沉淀。洗滌3次后渦旋震蕩重懸菌體，離心處理后去除上清液、留取沉淀。加無水乙醇與去離子水，靜置5～10 min，離心后去除上清液、留取沉淀。加0.5 mm玻璃珠，根據(jù)菌體體積加乙腈，震蕩5～10 min。加與乙腈等體積的體積分?jǐn)?shù)為70%的甲酸溶液，震蕩后離心處理，取上清液于質(zhì)譜靶板，晾干后加α-氰-4-羥基苯丙烯酸基質(zhì)溶液，再次晾干后采用MALDI-TOF MS儀器(德國(guó)布魯克公司)鑒定菌株，通過數(shù)據(jù)庫(kù)匹配鑒定結(jié)果。儀器說明書提示，鑒定分?jǐn)?shù)<1.5分為結(jié)果不可信。(2)Duplex-PCR：標(biāo)本置于加熱器中煮沸裂解，冷卻后離心處理，取上清液置于無菌離心管中，-80 ℃低溫保存。每次配制PCR預(yù)混液100份，混勻后分別置于96孔板孔中，而后將實(shí)驗(yàn)菌株DNA模板分別置于孔中，記錄后置于PCR儀器(美國(guó)BioBad公司)中擴(kuò)增。采用瓊脂糖凝膠電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用100BP DNA LadderMarker(成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司)測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量。以H37 Rv對(duì)應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性對(duì)照，以去離子水為陰性對(duì)照，采用Gel DocXR型成像儀(美國(guó)BioBad公司)分析電泳結(jié)果。結(jié)果示235 bp條帶的為MTC，136 bp條帶的為NTM，若無條帶則重復(fù)試驗(yàn)。(3)基因測(cè)序：對(duì)培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床陽性培養(yǎng)菌株進(jìn)行高壓滅菌，取混懸液1 mL煮沸裂解，而后以12 000 r·min-1的速率離心處理5 min，將上清液于-80 ℃下保存。對(duì)Duplex-PCR鑒定出的NTM進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，引物包括TB28S與TB264。PCR擴(kuò)增體系：離子水13 μL，Master Mix 25 μL×2(成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司)，2種引物各1 μL，DNA模板10 μL，記錄后采用PCR儀器進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo)(1)以Duplex-PCR為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算MALDI-TOF MS鑒定NTM的準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度及陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值。真陽性例數(shù)：兩種方式均鑒定為NTM的例數(shù)；假陽性例數(shù)：MALDI-TOF MS鑒定為NTM而Duplex-PCR鑒定為MTC的例數(shù)；假陰性例數(shù)：Duplex-PCR鑒定為NTM而MALDI-TOF MS鑒定為MTC的例數(shù)；真陰性例數(shù)：兩種方式均鑒定為MTC的例數(shù)。(2)以基因測(cè)序?yàn)榻饦?biāo)準(zhǔn)，計(jì)算MALDI-TOF MS鑒定NTM分型的符合率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，以百分比表示計(jì)數(shù)資料，采用Kappa檢驗(yàn)MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性，Kappa>0.74表示一致性高，0.4～0.74表示一致性中等，<0.4表示一致性低。

2 結(jié)果

2.1 MALDI-TOF MS鑒定NTM的效能分析MALDI-TOF MS鑒定NTM的準(zhǔn)確度94.90%，靈敏度90.00%，特異度96.15%，陽性預(yù)測(cè)值85.71%，陰性預(yù)測(cè)值97.40%。見表1。MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性Kappa值為0.846，一致性高。

表1 MALDI-TOF MS鑒定NTM的效能分析(n)

2.2 MALDI-TOF MS鑒定NTM分型的效能分析20例NTM中，基因測(cè)序鑒定出膿腫分枝桿菌14例，隱藏分枝桿菌、福西亞分枝桿菌、馬賽分枝桿菌各2例。1例馬賽分枝桿菌未能被MALDI-TOF MS鑒定出(鑒定分?jǐn)?shù)<1.5分)，其余鑒定結(jié)果均與金標(biāo)準(zhǔn)相符合，符合率95.00%。

表2 MALDI-TOF MS鑒定NTM分型的效能分析(n)

3 討論

NTM可引起結(jié)核樣病變，其能耐受常用的抗結(jié)核藥物，與結(jié)核分枝桿菌相比，對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求較為寬松[5]。因此，NTM對(duì)人類的危害巨大，加之NTM感染與MTC感染的治療存在較大差異，故及時(shí)、準(zhǔn)確地鑒定NTM與MTC對(duì)保障治療的有效性、安全性意義重大。

目前，Duplex-PCR仍是鑒定NTM與MTC的金標(biāo)準(zhǔn)，但該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中具有較大局限，如Duplex-PCR耗費(fèi)高、操作復(fù)雜、對(duì)技術(shù)人員要求高；不同分型NTM的PCR測(cè)序引物不同，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室測(cè)序方案不統(tǒng)一；Duplex-PCR的檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，不利于疾病的早期治療[6-7]。因此，探索新的NTM鑒定手段顯得愈發(fā)重要。近年來，國(guó)內(nèi)已有關(guān)于MALDI-TOF MS應(yīng)用于細(xì)菌鑒定、細(xì)菌分型、毒力檢測(cè)的報(bào)告，均顯示該技術(shù)鑒定細(xì)菌的準(zhǔn)確度高，且具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)[8-9]。但目前關(guān)于MALDI-TOF MS用于鑒定NTM及NTM分型的報(bào)告較少。本研究結(jié)果顯示，MALDI-TOF MS鑒定NTM的準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度較高，提示MALDI-TOF MS能有效鑒別NTM與MTC，可用于NTM的實(shí)驗(yàn)室診斷。質(zhì)譜鑒定原理為分析蛋白獲取細(xì)菌蛋白指紋圖譜，而后通過算法同數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，最終將與數(shù)據(jù)庫(kù)高度相似的作為鑒定結(jié)果并以分值形式體現(xiàn)[10]。因此，數(shù)據(jù)庫(kù)容量對(duì)MALDI-TOF MS的鑒定準(zhǔn)確度具有較大影響。本研究中，MALDI-TOF MS鑒定NTM的結(jié)果中有3例假陽性，2例假陰性。數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完善是發(fā)生鑒定錯(cuò)誤的重要原因，而分枝桿菌在傳代過程中容易因細(xì)胞壁丟失而發(fā)生變異，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)改變，故應(yīng)選用新傳代菌落的蛋白來完善數(shù)據(jù)庫(kù)[11]。本研究還顯示有1例馬賽分枝桿菌未能被MALDI-TOF MS鑒定出，但其余鑒定結(jié)果均與金標(biāo)準(zhǔn)相符合，提示MALDI-TOF MS能有效鑒定NTM分型。此外，本研究屬于回顧性分析，樣本的選取受到一定限制，且NTM的分型眾多而本研究只發(fā)現(xiàn)了其中4類，故MALDI-TOF MS鑒定NTM及其分型的價(jià)值，仍有待未來展開大樣本的前瞻性研究做出進(jìn)一步分析。

綜上所述，MALDI-TOF MS技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定NTM及NTM分型，在NTM的實(shí)驗(yàn)室診斷中具有較高應(yīng)用價(jià)值。