白璐，刁榮華，阮潛瑛，王世春，劉奇，王澤蓉，易中梅，任章銀

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科;b.輸血科，重慶 400038)

冷沉淀凝血因子是指將保存期內(nèi)的新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma，F(xiàn)FP)在1～6 ℃融化后，分離出大部分的血漿，并將剩余的不溶解物質(zhì)在1 h內(nèi)速凍成固態(tài)的成分血[1]，其主要含有豐富的血漿凝固蛋白，包括凝血因子Ⅷ(FⅧ)、凝血因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)、纖維結(jié)合蛋白(fibronectin，F(xiàn)n)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)和血小板微粒(platelet microparticle，PMP)等[2]。冷沉淀作為一種重要的血液制劑，主要用于凝血因子缺乏及大出血患者。冷沉淀凝血因子的輸注，目前尚未實(shí)現(xiàn)“零風(fēng)險(xiǎn)”，有必要進(jìn)行嚴(yán)格的檢測(cè)及病毒滅活，大量文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)血漿進(jìn)行病毒滅活處理后可大大降低因輸血引起的病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)[3-4]，但是病毒滅活過程會(huì)導(dǎo)致血漿中部分凝血因子損失[5]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及操作規(guī)范中未明確說明制備冷沉淀凝血因子的原料血漿是否需進(jìn)行病毒滅活。為提高臨床用血安全性，探討采用病毒滅活后的FFP制備冷沉淀凝血因子是否符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，本研究選取兩種不同來源的病毒滅活FFP制備冷沉淀凝血因子，比較其制備效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑血漿采集機(jī)(XJC2000，四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司)及配套的一次性耗材(批號(hào)180822)，一次性使用去白采血六聯(lián)袋(400 mL，批號(hào)180424，四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司)，大容量低溫離心機(jī)(J6-MC，美國(guó)貝克曼)，血漿速凍箱(天津市正源制冷設(shè)備有限公司)，醫(yī)用血漿病毒滅活柜(山東中?？?及配套的一次性輸血過濾器(批號(hào)01180819)，泰爾茂無菌接駁機(jī)(TSCD-Ⅱ)，一次性轉(zhuǎn)移空袋(200 mL，批號(hào)180809，四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司)，電子天平(ES-1100s，長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司)，潔凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FI，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，冰凍血漿解凍箱(KJX-Ⅲ，蘇州市醫(yī)用儀器廠)，Ⅷ因子試劑盒(批號(hào)547669，希森美康醫(yī)用電子有限公司)，纖維蛋白原試劑盒(批號(hào)547544，希森美康醫(yī)用電子有限公司)。

1.2 病毒滅活FFP的制備(1)全血組：選取2019年7—8月獻(xiàn)血者無償捐獻(xiàn)的全血15袋(每袋400 mL)分離制備新鮮血漿。全血及多聯(lián)袋先采用高速冷凍離心機(jī)以3 397 g、4 ℃條件離心10 min，分離血漿，同條件對(duì)血漿二次離心8 min，分離殘留紅細(xì)胞待病毒滅活，每袋容量為200 mL，對(duì)懸浮紅細(xì)胞再做濾除白細(xì)胞處理。(2)單采組：選取2019年8—9月獻(xiàn)血者無償捐獻(xiàn)的單采血漿15袋(每袋200 mL)。兩組血漿在無菌室百級(jí)超凈工作臺(tái)內(nèi)連接一次性使用病毒滅活裝置配套用輸血過濾器，把加入亞甲藍(lán)的血漿袋放入病毒滅活柜中進(jìn)行光照處理，光照后的血漿通過配套過濾耗材濾除亞甲藍(lán)后，立即放入-50 ℃血漿速凍箱速凍，待成固態(tài)后置入-18 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。所有操作均按照《血站技術(shù)操作規(guī)程(2019版)》的要求進(jìn)行，整個(gè)制備過程<6 h。

1.3 冷沉淀凝血因子的制備將保存48 h后的兩種病毒滅活FFP取出放入水溫恒定在4 ℃的冰凍血漿解凍箱內(nèi)緩慢融化，剩少許冰渣取出用無菌接駁機(jī)連接一次性使用轉(zhuǎn)移空袋，血漿連同空袋一起離心(2 496 g，4 ℃，15 min)，全程冷鏈控制。離心后用分漿夾分出上層血漿，每袋剩下(30±5)mL的血漿及白色絮狀物稱量斷開，微機(jī)處理貼簽后立即放入速凍冰箱速凍，待成固態(tài)后置入-18 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 標(biāo)本留取及檢測(cè)在全血組血漿經(jīng)二次離心后及單采組采集完成后留取新鮮血漿標(biāo)本，標(biāo)記好后立即冰凍保存。于37 ℃水浴箱快速融化兩組冷沉淀凝血因子及新鮮血漿標(biāo)本，搖勻融化后的冷沉淀并及時(shí)留取標(biāo)本，立即送檢。標(biāo)本按照儀器操作說明書和試劑使用說明書進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過程<1 h。

2 結(jié)果

2.1 Fib兩組FFP中Fib量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。全血組冷沉淀中Fib量和回收率均高于單采組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組病毒滅活FFP及制備的冷沉淀中Fib情況比較

2.2 FⅧ兩組FFP中FⅧ量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。全血組冷沉淀中FⅧ量和回收率均高于單采組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 兩組病毒滅活FFP及制備的冷沉淀中FⅧ情況比較

3 討論

冷沉淀凝血因子作為一種血液制劑，在臨床應(yīng)用較廣泛，對(duì)各種凝血因子缺乏的患者可以快速補(bǔ)充并減少出血風(fēng)險(xiǎn)，保證外科手術(shù)的順利實(shí)施。輸注未經(jīng)病毒滅活的冷沉淀凝血因子存在通過血液傳播相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)，可通過制備病毒滅活冷沉淀凝血因子的原料血漿來解決[7]。目前國(guó)內(nèi)外運(yùn)用最為普遍的一種血漿病毒滅活方法為亞甲藍(lán)光化學(xué)法，亞甲藍(lán)是一種表面攜帶正電荷的光敏劑，經(jīng)最大吸收波長(zhǎng)(661±2)nm、光照強(qiáng)度25 000～40 000 lx的可見光照射35 min，亞甲藍(lán)與血漿中的病毒核酸及脂質(zhì)包膜結(jié)合，使病毒的核酸鏈斷裂，從而抑制其復(fù)制，達(dá)到其滅活效果[8]。

雖然病毒滅活過程在一定程度上影響血漿各凝血因子活性，但是對(duì)提高臨床輸注安全有重大意義[9]。本研究結(jié)果顯示，兩組新鮮冰凍血漿中Fib、FⅧ含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，全血組冷沉淀中Fib和FⅧ含量和回收率均高于單采組，說明在整個(gè)病毒滅活過程中，凝血因子損失較大。冷沉淀凝血因子活性除受獻(xiàn)血者自身凝血因子水平影響外，還跟血液采集過程、制備時(shí)間、溫度和制備工藝有一定關(guān)系。全血組采集時(shí)間在5～10 min完成，由于全部來自站內(nèi)獻(xiàn)血，采集后立即放入2～6 ℃血液冷藏箱保存，無血液運(yùn)輸?shù)韧庠跍囟燃皶r(shí)間影響。單采組采集時(shí)間為(50±13)min，整個(gè)采集過程暴露在室溫的時(shí)間約為全血組的5倍，這將造成滅活后單采組凝血因子含量低于全血組。如果同一時(shí)間段制備量較大(一批次>30袋)，也將增加冷沉淀制劑在室溫暴露時(shí)間，影響FⅧ因子回收率。兩組的Fib回收率均偏低，在低溫情況下Fib容易聚集，形成包裹后經(jīng)病毒滅活濾除亞甲藍(lán)過濾器丟失較明顯，完全融化后的血漿Fib會(huì)混入上清液，很難經(jīng)過離心再次分離，從而造成部分Fib的丟失，回收率低于FⅧ。因此，在同一時(shí)間段減少制備量、縮短制備時(shí)間及全程冷鏈質(zhì)量控制非常有必要。本站在制備方法及流程上與其他血站有一定不同，因此本研究病毒滅活FFP制備的冷沉淀中FⅧ、Fib含量及回收率比相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道要低[10]。

總之，全血組病毒滅活FFP制備的冷沉淀凝血因子質(zhì)量高于單采組，建議采用全血來源的病毒滅活FFP作為制備冷沉淀凝血因子的原料血漿。本研究樣本量小，待優(yōu)化制備流程后可進(jìn)一步多留樣本來跟蹤檢測(cè)冷沉淀凝血因子質(zhì)量。如果能篩查出自身凝血因子較好的獻(xiàn)血者，可將其作為固定單采血漿獻(xiàn)血者，通過進(jìn)一步控制好原料血漿質(zhì)量、冷鏈條件及制備工藝等，冷沉淀FⅧ、Fib含量將會(huì)更高，冷沉淀凝血因子質(zhì)量更加有保障。