張宏偉，王建華，陳本龍，麻麗丹，宋 喆，蒲 靜

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637002；2.天津海關(guān)，天津 300456；3.丹東海關(guān)，遼寧丹東 118002；4.北京海關(guān)，北京 100026）

在病毒學(xué)分類中，豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）均屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，為單股、正鏈RNA 病毒，具有相似的基因組結(jié)構(gòu)，其基因組全長(zhǎng)約12.3 kb，由5'非編碼區(qū)（5'UTR）、1 個(gè)大的開(kāi)放閱讀框和3'非編碼區(qū)（3'UTR）組成，編碼1 個(gè)含有約4 000 個(gè)氨基酸的前體多聚蛋白。該前體多聚蛋白在宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶和病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的作用下，被加工為病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由CSFV引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，曾給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失[2]。自20 世紀(jì)50年代以來(lái)，通過(guò)實(shí)施CSFV 兔化弱毒苗免疫接種，我國(guó)CSF 疫情已得到有效控制，發(fā)病率和死亡率顯著降低，但以非典型、低齡化和散發(fā)性為特點(diǎn)的非典型CSF 在各地時(shí)有發(fā)生[3]。早在1971年，Stewart 等[4]就觀察到BVDV 對(duì)豬的自然感染現(xiàn)象；1996年，王新平等[5]從我國(guó)疑似CSF 病料中檢出BVDV。近年來(lái)豬的BVDV 感染在我國(guó)部分地區(qū)豬群中呈散發(fā)性、地方性流行態(tài)勢(shì)[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，豬感染BVDV 后可產(chǎn)生類似慢性CSF 的臨床癥狀和病理變化，從而干擾CSF 的臨床診斷[9]。此外，豬感染BVDV 后產(chǎn)生的BVDV 抗體對(duì)CSFV 有一定的抑制作用，會(huì)影響CSF 疫苗的免疫效果[9]。因此，了解豬群中的BVDV 感染狀況，對(duì)于防范豬群BVDV 感染和做好CSF 防制和凈化工作具有重要指導(dǎo)意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員根據(jù)CSFV 和BVDV 基因組各自的5'端的保守區(qū)，已建立了多種單一的檢測(cè)CSFV 和BVDV 的熒光RT-PCR 方法[10-13]，而同時(shí)檢測(cè)豬源臨床樣本中的CSFV 和BVDV 的雙重?zé)晒釸T-PCR 檢測(cè)方法則少見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以CSFV 與BVDV 的5'端保守區(qū)為擴(kuò)增靶序列，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan 探針，建立了一種同時(shí)鑒別檢測(cè)CSFV 與BVDV 的雙重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法，為CSF 防制和凈化提供了一種有效的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 病毒、RNA 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照和主要試劑

CSFV、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）以 及BVDV NADL 株（BVDV-1）和890 株（BVDV-2）的核酸材料，由天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心反芻動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、One Step PrimeScript? RT-PCR Kit（Perfect Real Time），購(gòu)自大連寶生物工程（北京）有限公司。RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7，購(gòu)自Promega 公司。

1.2 引物和探針設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 發(fā)表的CSFV 毒株基因序列（AJ133738.1）、BVDV-1 型NADL 毒株基因序列（AJ133738.1）和BVDV-2 型890 毒株基因序列（AF039180.1），在NCBI 網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov/），對(duì)這3 株病毒的5'UTR 序列進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，選取BVDV-1 型和BVDV-2 型5'UTR 序列的共同保守序列設(shè)計(jì)合成引物對(duì)和探針，選取CSFV 5'UTR 序列的保守序列設(shè)計(jì)合成引物對(duì)和探針，由Sangon Biotech 公司合成。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定的引物及探針序列見(jiàn)表1，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為91 bp。

表1 引物與探針序列

1.3 標(biāo)準(zhǔn)RNA 對(duì)照制備

分別選取CSFV 毒株、BVDV-1 型NADL 毒株和BVDV-2 型890 毒株的5'UTR 序列，送由上海杰瑞生物技術(shù)公司合成并克隆至PCR2.1 載體連接，構(gòu)建重組克隆載體PCR2.1-CSFV-5'UTR、PCR2.1-BVDV-1-5'UTR 和PCR2.1-BVDV-2-5'UTR，然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞；在AMP+LB 平板上挑選單個(gè)菌落，接種于新鮮AMP+LB 培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒；以經(jīng)PstI 酶切線性化的重組質(zhì)粒DNA 為模板，采用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄；對(duì)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，經(jīng)RQ1 DNA 酶消化及純化后即制備成含有擴(kuò)增靶序列的RNA 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，分別命名為CSFV-5'UTRRNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTRRNA；用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度并按相應(yīng)公式換算其拷貝數(shù)，濃度分別為2.7×109、3.6×109和3.2×109拷貝/μL。

1.4 熒光RT-PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

采 用One Step PrimeScript ? RT-PCR Kit（Perfect Real Time）試 劑，在Light Cycler?480 Ⅱ熒光PCR（Rochi）儀上，以CSFV-5'UTRRNA（2.7×106拷 貝/μL）、BVDV-1-5'UTR-RNA（3.6×106拷 貝/μL）和BVDV-2-5'UTR-RNA（3.2×106拷貝/μL）為膜板，首先確定在25 μL反應(yīng)體系中的各條引物和探針的最適濃度，然后確定最適退火和擴(kuò)增溫度，進(jìn)而確定最適熒光RTPCR 反應(yīng)條件。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和敏感性試驗(yàn)

對(duì)CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA 進(jìn)行10 倍系列稀釋，然后分別吸取1 μL，按優(yōu)化的熒光RT-PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)；反應(yīng)結(jié)束后，以Ct 值為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)RNA 對(duì)照模板起始拷貝數(shù)濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)確定檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)RNA 對(duì)照模板的最低拷貝數(shù)。

1.6 重復(fù)性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)

對(duì)3 個(gè)濃度的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 各 取1 μL 為模板，分別進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)，確定該方法的重復(fù)性。以CSFV、BVDV、PRRSV、PEDV 和TGEV 的核酸為模板，按優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn)，確定該熒光RT-PCR 方法的特異性。

1.7 臨床樣本檢測(cè)

對(duì)2017—2019年本實(shí)驗(yàn)室保留的采自國(guó)內(nèi)豬場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的152 份豬淋巴結(jié)樣本，用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 試劑盒提取樣本RNA，采用GB/T 27540—2011 的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR（簡(jiǎn)稱國(guó)標(biāo)方法）進(jìn)行CSFV 核酸檢測(cè)，采用OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》（2018版第3.4.7 章）的熒光RT-PCR（簡(jiǎn)稱OIE 方法）進(jìn)行BVDV 核酸檢測(cè)，同時(shí)采用本研究所建立的方法進(jìn)行CSFV 和BVDV 核酸檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該方法的實(shí)用性和符合率。

2 結(jié)果

2.1 熒光RT-PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

在Light Cycler? 480 Ⅱ熒光PCR（Rochi）儀上，以CSFV-5'UTR-RNA（2.7×106拷貝/μL）、BVDV-1-5'UTR-RNA（3.6×106拷 貝/μL）和BVDV-2-5'UTR-RNA（3.2×106拷貝/μL）為模板，進(jìn)行不同濃度組合的引物和標(biāo)記探針以及56～61 ℃范圍內(nèi)退火延伸溫度的優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)確定的CSFV 和BVDV 雙重?zé)晒釸T-PCR 反應(yīng)體系為：在25 μL 反應(yīng)體系中，依次加入2×One Step RT-PCR buffer Ⅲ12.5 μL，TaKaRa ExTaqHS（5 U/μL）0.5 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL，BVDV-F（10 mmol/L）、BVDV-R（10 mmol/L）、BVDV-P（4 mmol/L）、CSFV-F（10 mmol/L）、CSFV-R（10 mmol/L）、CSFV-P（4 mmol/L）各0.5 μL，模板1 μL，補(bǔ)足水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，然后95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)。在每次循環(huán)的60 ℃延伸擴(kuò)增結(jié)束前，采集FAM 和HEX 通道的熒光信號(hào)。最適反應(yīng)條件下的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 的動(dòng)力學(xué)曲線分別見(jiàn)圖1-A、1-B 和1-C。

2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限

圖1 熒光RT-PCR 動(dòng)力學(xué)曲線

對(duì)10 倍系列稀釋的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA，按優(yōu)化后的雙重?zé)晒釸T-PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增曲線分別見(jiàn)圖2-A、2-B 和2-C；以起始模板濃度的對(duì)數(shù)為X 軸、Ct 值為Y 軸，繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見(jiàn)圖3-A、3-B 和3-C。對(duì)CSFV-5'UTRRNA 的定量檢測(cè)的線性范圍為2.7×101～2.7×108拷貝/μL，線性關(guān)系表達(dá)式為Y=-3.476X+41.7，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999；對(duì)BVDV-1-5'UTR-RNA 的定量檢測(cè)的線性范圍為3.6×101～3.6×109拷貝/μL，線性關(guān)系表達(dá)式為Y=-3.451X+41.53，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999；對(duì)BVDV-2-5'UTR-RNA 的線性范圍為3.2×101～3.2×109拷貝/μL，線性關(guān)系表達(dá)式為Y=-3.39X+41.39，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999。由圖3-A、3-B 和3-C 可知，該方法對(duì)CSFV-5'UTRRNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTRRNA 最低可分別檢出27、36 和32 拷貝/μL。

圖2 熒光RT-PCR 擴(kuò)增曲線

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

分別選取3 個(gè)濃度的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 標(biāo) 準(zhǔn)對(duì)照為模板，按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)稀釋度的Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）及變異系數(shù)（CV）分別見(jiàn)表2、表3 和表4。由表可見(jiàn)，組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)的Ct 值變異系數(shù)均小于1.5%，表明本試驗(yàn)所建立的熒光RT-PCR 檢測(cè)體系穩(wěn)定，具有良好的重復(fù)性。

2.4 特異性試驗(yàn)

用所建立的方法同時(shí)對(duì)CSFV、BVDV、PRRSV、PEDV 和TGEV 的核酸材料進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，僅CSFV 和BVDV的核酸呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，而PRRSV、PEDV和TGEV 的核酸材料均無(wú)擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，表明本研究建立的熒光PCR 方法具有良好的特異性。

圖3 熒光RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 CSFV-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表3 BVDV-1-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 BVDV-2-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

圖4 二重?zé)晒釸T-PCR 檢測(cè)VDV 和CSFVB 的特異性

2.5 臨床樣本檢測(cè)

在152 份豬淋巴結(jié)樣本中，用國(guó)標(biāo)方法檢出CSFV 核酸陽(yáng)性樣品17 份，其余樣品為CSFV 核酸陰性，用OIE 方法檢出BVDV 核酸樣品4 份，其余樣品為BVDV 核酸陰性。對(duì)這152 份豬淋巴結(jié)樣本，用本研究所建立方法檢出單一CSFV 核酸陽(yáng)性樣品16 份、單一BVDV 核酸陽(yáng)性樣品3 份、CSFV 核酸和BVDV 核酸雙陽(yáng)性的樣品1 份，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法和OIE 方法一致。

3 討論

流行病學(xué)研究表明，繁殖母豬的CSFV 持續(xù)感染是引發(fā)仔豬發(fā)生CSF 的源頭。疫病凈化是根除動(dòng)物疫病最經(jīng)濟(jì)的有效手段。因此，加大種豬場(chǎng)CSF 病原學(xué)監(jiān)測(cè)力度，堅(jiān)決淘汰感染母豬，培育陰性種豬群和后備種豬群，是實(shí)現(xiàn)種豬場(chǎng)的CSF 凈化乃至根除的有效措施。目前我國(guó)已開(kāi)始實(shí)施了種豬場(chǎng)CSF 凈化計(jì)劃，通過(guò)實(shí)施CSF 凈化顯著提高了養(yǎng)豬企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益，減少了疫病損失并大大降低了防疫成本[14]。然而。在種豬及生豬生產(chǎn)實(shí)際工作中，接種使用BVDV 污染的胎牛血清和牛睪丸制備的CSF 細(xì)胞疫苗，或者飼喂污染BVDV 的飼料，均可造成豬的BVDV 感染[15-16]。這不僅增加了CSF 診斷和防制的復(fù)雜性，也給種豬場(chǎng)的CSF陰性種豬群和后備種豬群的評(píng)價(jià)帶來(lái)干擾。因此，在豬群中開(kāi)展CSFV 和BVDV 檢測(cè)，對(duì)我國(guó)CSF的防控和凈化及無(wú)病場(chǎng)（區(qū)）的評(píng)價(jià)具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法可同時(shí)檢測(cè)多種病原核酸，具有一次擴(kuò)增反應(yīng)就能快速、敏感、特異地鑒別和檢測(cè)多種病原的優(yōu)點(diǎn)?；贑SFV 與BVDV 的5'端保守區(qū)，設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針，本研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)CSFV 與BVDV的雙重?zé)晒釶CR 檢測(cè)方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法僅對(duì)CSFV 與BVDV 呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增，不與PRRSV、PEDV 和TGEV 等常見(jiàn)相關(guān)豬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，最低可分別檢出27 個(gè)拷貝數(shù)的BVDV-1-5'UTR-RNA 對(duì)照、36 個(gè)拷貝數(shù)的BVDV-2-5'UTR-RNA 對(duì)照和32 個(gè)拷貝數(shù)的CSFV-5'UTRRNA 對(duì)照。該方法的組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)的Ct 值變異系數(shù)介于0.11%～1.20%，具有良好的重現(xiàn)性。對(duì)152 份國(guó)內(nèi)豬組織樣本的檢測(cè)結(jié)果表明，本研究建立的方法與對(duì)應(yīng)的國(guó)標(biāo)和OIE 方法的檢出結(jié)果一致，且具有節(jié)省試劑和檢測(cè)效率高的優(yōu)點(diǎn)，可用于豬淋巴結(jié)等臨床樣本中CSFV 與BVDV 的同時(shí)檢測(cè)。