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        豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒雙重?zé)晒釸T-PCR 檢測方法的建立

        2020-09-07 09:58:42張宏偉王建華陳本龍麻麗丹
        中國動(dòng)物檢疫 2020年9期
        關(guān)鍵詞:探針核酸引物

        張宏偉,王建華,陳本龍,麻麗丹,宋 喆,蒲 靜

        (1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,四川南充 637002;2.天津海關(guān),天津 300456;3.丹東海關(guān),遼寧丹東 118002;4.北京海關(guān),北京 100026)

        在病毒學(xué)分類中,豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)和牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)均屬于黃病毒科瘟病毒屬成員,為單股、正鏈RNA 病毒,具有相似的基因組結(jié)構(gòu),其基因組全長約12.3 kb,由5'非編碼區(qū)(5'UTR)、1 個(gè)大的開放閱讀框和3'非編碼區(qū)(3'UTR)組成,編碼1 個(gè)含有約4 000 個(gè)氨基酸的前體多聚蛋白。該前體多聚蛋白在宿主細(xì)胞信號肽酶和病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的作用下,被加工為病毒的各種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。

        豬瘟(classical swine fever,CSF)是由CSFV引起豬的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病,曾給我國養(yǎng)豬業(yè)造成很大經(jīng)濟(jì)損失[2]。自20 世紀(jì)50年代以來,通過實(shí)施CSFV 兔化弱毒苗免疫接種,我國CSF 疫情已得到有效控制,發(fā)病率和死亡率顯著降低,但以非典型、低齡化和散發(fā)性為特點(diǎn)的非典型CSF 在各地時(shí)有發(fā)生[3]。早在1971年,Stewart 等[4]就觀察到BVDV 對豬的自然感染現(xiàn)象;1996年,王新平等[5]從我國疑似CSF 病料中檢出BVDV。近年來豬的BVDV 感染在我國部分地區(qū)豬群中呈散發(fā)性、地方性流行態(tài)勢[6-8]。研究發(fā)現(xiàn),豬感染BVDV 后可產(chǎn)生類似慢性CSF 的臨床癥狀和病理變化,從而干擾CSF 的臨床診斷[9]。此外,豬感染BVDV 后產(chǎn)生的BVDV 抗體對CSFV 有一定的抑制作用,會(huì)影響CSF 疫苗的免疫效果[9]。因此,了解豬群中的BVDV 感染狀況,對于防范豬群BVDV 感染和做好CSF 防制和凈化工作具有重要指導(dǎo)意義。

        近年來,國內(nèi)外研究人員根據(jù)CSFV 和BVDV 基因組各自的5'端的保守區(qū),已建立了多種單一的檢測CSFV 和BVDV 的熒光RT-PCR 方法[10-13],而同時(shí)檢測豬源臨床樣本中的CSFV 和BVDV 的雙重?zé)晒釸T-PCR 檢測方法則少見報(bào)道。為此,本研究以CSFV 與BVDV 的5'端保守區(qū)為擴(kuò)增靶序列,設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan 探針,建立了一種同時(shí)鑒別檢測CSFV 與BVDV 的雙重?zé)晒釶CR 檢測方法,為CSF 防制和凈化提供了一種有效的技術(shù)手段。

        1 材料與方法

        1.1 病毒、RNA 標(biāo)準(zhǔn)對照和主要試劑

        CSFV、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸道綜合征病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)以 及BVDV NADL 株(BVDV-1)和890 株(BVDV-2)的核酸材料,由天津海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測中心反芻動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室保存。TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、One Step PrimeScript? RT-PCR Kit(Perfect Real Time),購自大連寶生物工程(北京)有限公司。RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System T7,購自Promega 公司。

        1.2 引物和探針設(shè)計(jì)與合成

        根據(jù)GenBank 發(fā)表的CSFV 毒株基因序列(AJ133738.1)、BVDV-1 型NADL 毒株基因序列(AJ133738.1)和BVDV-2 型890 毒株基因序列(AF039180.1),在NCBI 網(wǎng)站(www.ncbi.nlm.nih.gov/),對這3 株病毒的5'UTR 序列進(jìn)行BLAST序列比對,選取BVDV-1 型和BVDV-2 型5'UTR 序列的共同保守序列設(shè)計(jì)合成引物對和探針,選取CSFV 5'UTR 序列的保守序列設(shè)計(jì)合成引物對和探針,由Sangon Biotech 公司合成。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定的引物及探針序列見表1,擴(kuò)增片段長度為91 bp。

        表1 引物與探針序列

        1.3 標(biāo)準(zhǔn)RNA 對照制備

        分別選取CSFV 毒株、BVDV-1 型NADL 毒株和BVDV-2 型890 毒株的5'UTR 序列,送由上海杰瑞生物技術(shù)公司合成并克隆至PCR2.1 載體連接,構(gòu)建重組克隆載體PCR2.1-CSFV-5'UTR、PCR2.1-BVDV-1-5'UTR 和PCR2.1-BVDV-2-5'UTR,然后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞;在AMP+LB 平板上挑選單個(gè)菌落,接種于新鮮AMP+LB 培養(yǎng)基中,37 ℃過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒;以經(jīng)PstI 酶切線性化的重組質(zhì)粒DNA 為模板,采用RiboMAX Large Scale RNA Production System-T7試劑盒,按說明書進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄;對體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,經(jīng)RQ1 DNA 酶消化及純化后即制備成含有擴(kuò)增靶序列的RNA 標(biāo)準(zhǔn)對照,分別命名為CSFV-5'UTRRNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTRRNA;用核酸蛋白分析儀測定其濃度并按相應(yīng)公式換算其拷貝數(shù),濃度分別為2.7×109、3.6×109和3.2×109拷貝/μL。

        1.4 熒光RT-PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

        采 用One Step PrimeScript ? RT-PCR Kit(Perfect Real Time)試 劑,在Light Cycler?480 Ⅱ熒光PCR(Rochi)儀上,以CSFV-5'UTRRNA(2.7×106拷 貝/μL)、BVDV-1-5'UTR-RNA(3.6×106拷 貝/μL)和BVDV-2-5'UTR-RNA(3.2×106拷貝/μL)為膜板,首先確定在25 μL反應(yīng)體系中的各條引物和探針的最適濃度,然后確定最適退火和擴(kuò)增溫度,進(jìn)而確定最適熒光RTPCR 反應(yīng)條件。

        1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和敏感性試驗(yàn)

        對CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA 進(jìn)行10 倍系列稀釋,然后分別吸取1 μL,按優(yōu)化的熒光RT-PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn);反應(yīng)結(jié)束后,以Ct 值為橫坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)RNA 對照模板起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標(biāo),繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線,同時(shí)確定檢測標(biāo)準(zhǔn)RNA 對照模板的最低拷貝數(shù)。

        1.6 重復(fù)性試驗(yàn)和特異性試驗(yàn)

        對3 個(gè)濃度的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 各 取1 μL 為模板,分別進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn),確定該方法的重復(fù)性。以CSFV、BVDV、PRRSV、PEDV 和TGEV 的核酸為模板,按優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行試驗(yàn),確定該熒光RT-PCR 方法的特異性。

        1.7 臨床樣本檢測

        對2017—2019年本實(shí)驗(yàn)室保留的采自國內(nèi)豬場和屠宰場的152 份豬淋巴結(jié)樣本,用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 試劑盒提取樣本RNA,采用GB/T 27540—2011 的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR(簡稱國標(biāo)方法)進(jìn)行CSFV 核酸檢測,采用OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊》(2018版第3.4.7 章)的熒光RT-PCR(簡稱OIE 方法)進(jìn)行BVDV 核酸檢測,同時(shí)采用本研究所建立的方法進(jìn)行CSFV 和BVDV 核酸檢測,以評價(jià)該方法的實(shí)用性和符合率。

        2 結(jié)果

        2.1 熒光RT-PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化

        在Light Cycler? 480 Ⅱ熒光PCR(Rochi)儀上,以CSFV-5'UTR-RNA(2.7×106拷貝/μL)、BVDV-1-5'UTR-RNA(3.6×106拷 貝/μL)和BVDV-2-5'UTR-RNA(3.2×106拷貝/μL)為模板,進(jìn)行不同濃度組合的引物和標(biāo)記探針以及56~61 ℃范圍內(nèi)退火延伸溫度的優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)確定的CSFV 和BVDV 雙重?zé)晒釸T-PCR 反應(yīng)體系為:在25 μL 反應(yīng)體系中,依次加入2×One Step RT-PCR buffer Ⅲ12.5 μL,TaKaRa ExTaqHS(5 U/μL)0.5 μL,PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.5 μL,BVDV-F(10 mmol/L)、BVDV-R(10 mmol/L)、BVDV-P(4 mmol/L)、CSFV-F(10 mmol/L)、CSFV-R(10 mmol/L)、CSFV-P(4 mmol/L)各0.5 μL,模板1 μL,補(bǔ)足水至25 μL。反應(yīng)參數(shù)為:42 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,然后95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,45 個(gè)循環(huán)。在每次循環(huán)的60 ℃延伸擴(kuò)增結(jié)束前,采集FAM 和HEX 通道的熒光信號。最適反應(yīng)條件下的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 的動(dòng)力學(xué)曲線分別見圖1-A、1-B 和1-C。

        2.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢出限

        圖1 熒光RT-PCR 動(dòng)力學(xué)曲線

        對10 倍系列稀釋的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA,按優(yōu)化后的雙重?zé)晒釸T-PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行檢測,擴(kuò)增曲線分別見圖2-A、2-B 和2-C;以起始模板濃度的對數(shù)為X 軸、Ct 值為Y 軸,繪制成的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖3-A、3-B 和3-C。對CSFV-5'UTRRNA 的定量檢測的線性范圍為2.7×101~2.7×108拷貝/μL,線性關(guān)系表達(dá)式為Y=-3.476X+41.7,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999;對BVDV-1-5'UTR-RNA 的定量檢測的線性范圍為3.6×101~3.6×109拷貝/μL,線性關(guān)系表達(dá)式為Y=-3.451X+41.53,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999;對BVDV-2-5'UTR-RNA 的線性范圍為3.2×101~3.2×109拷貝/μL,線性關(guān)系表達(dá)式為Y=-3.39X+41.39,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999。由圖3-A、3-B 和3-C 可知,該方法對CSFV-5'UTRRNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTRRNA 最低可分別檢出27、36 和32 拷貝/μL。

        圖2 熒光RT-PCR 擴(kuò)增曲線

        2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

        分別選取3 個(gè)濃度的CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA 和BVDV-2-5'UTR-RNA 標(biāo) 準(zhǔn)對照為模板,按優(yōu)化的反應(yīng)條件進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn),每個(gè)稀釋度的Ct 值和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)及變異系數(shù)(CV)分別見表2、表3 和表4。由表可見,組內(nèi)和組間重復(fù)試驗(yàn)的Ct 值變異系數(shù)均小于1.5%,表明本試驗(yàn)所建立的熒光RT-PCR 檢測體系穩(wěn)定,具有良好的重復(fù)性。

        2.4 特異性試驗(yàn)

        用所建立的方法同時(shí)對CSFV、BVDV、PRRSV、PEDV 和TGEV 的核酸材料進(jìn)行檢測,擴(kuò)增結(jié)果見圖4。由圖可知,僅CSFV 和BVDV的核酸呈現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,而PRRSV、PEDV和TGEV 的核酸材料均無擴(kuò)增曲線出現(xiàn),表明本研究建立的熒光PCR 方法具有良好的特異性。

        圖3 熒光RT-PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        表2 CSFV-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

        表3 BVDV-1-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

        表4 BVDV-2-5'UTR-RNA 熒光RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

        圖4 二重?zé)晒釸T-PCR 檢測VDV 和CSFVB 的特異性

        2.5 臨床樣本檢測

        在152 份豬淋巴結(jié)樣本中,用國標(biāo)方法檢出CSFV 核酸陽性樣品17 份,其余樣品為CSFV 核酸陰性,用OIE 方法檢出BVDV 核酸樣品4 份,其余樣品為BVDV 核酸陰性。對這152 份豬淋巴結(jié)樣本,用本研究所建立方法檢出單一CSFV 核酸陽性樣品16 份、單一BVDV 核酸陽性樣品3 份、CSFV 核酸和BVDV 核酸雙陽性的樣品1 份,檢測結(jié)果與國標(biāo)方法和OIE 方法一致。

        3 討論

        流行病學(xué)研究表明,繁殖母豬的CSFV 持續(xù)感染是引發(fā)仔豬發(fā)生CSF 的源頭。疫病凈化是根除動(dòng)物疫病最經(jīng)濟(jì)的有效手段。因此,加大種豬場CSF 病原學(xué)監(jiān)測力度,堅(jiān)決淘汰感染母豬,培育陰性種豬群和后備種豬群,是實(shí)現(xiàn)種豬場的CSF 凈化乃至根除的有效措施。目前我國已開始實(shí)施了種豬場CSF 凈化計(jì)劃,通過實(shí)施CSF 凈化顯著提高了養(yǎng)豬企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益,減少了疫病損失并大大降低了防疫成本[14]。然而。在種豬及生豬生產(chǎn)實(shí)際工作中,接種使用BVDV 污染的胎牛血清和牛睪丸制備的CSF 細(xì)胞疫苗,或者飼喂污染BVDV 的飼料,均可造成豬的BVDV 感染[15-16]。這不僅增加了CSF 診斷和防制的復(fù)雜性,也給種豬場的CSF陰性種豬群和后備種豬群的評價(jià)帶來干擾。因此,在豬群中開展CSFV 和BVDV 檢測,對我國CSF的防控和凈化及無病場(區(qū))的評價(jià)具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

        多重實(shí)時(shí)熒光PCR 方法可同時(shí)檢測多種病原核酸,具有一次擴(kuò)增反應(yīng)就能快速、敏感、特異地鑒別和檢測多種病原的優(yōu)點(diǎn)?;贑SFV 與BVDV 的5'端保守區(qū),設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan探針,本研究建立了一種同時(shí)檢測CSFV 與BVDV的雙重?zé)晒釶CR 檢測方法。試驗(yàn)結(jié)果表明,該方法僅對CSFV 與BVDV 呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增,不與PRRSV、PEDV 和TGEV 等常見相關(guān)豬病病毒發(fā)生交叉反應(yīng),最低可分別檢出27 個(gè)拷貝數(shù)的BVDV-1-5'UTR-RNA 對照、36 個(gè)拷貝數(shù)的BVDV-2-5'UTR-RNA 對照和32 個(gè)拷貝數(shù)的CSFV-5'UTRRNA 對照。該方法的組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)的Ct 值變異系數(shù)介于0.11%~1.20%,具有良好的重現(xiàn)性。對152 份國內(nèi)豬組織樣本的檢測結(jié)果表明,本研究建立的方法與對應(yīng)的國標(biāo)和OIE 方法的檢出結(jié)果一致,且具有節(jié)省試劑和檢測效率高的優(yōu)點(diǎn),可用于豬淋巴結(jié)等臨床樣本中CSFV 與BVDV 的同時(shí)檢測。

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