（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticam，MG）感染主要引起雞的呼吸道癥狀，又稱雞慢性呼吸道?。–RD），表現(xiàn)為氣管、肺和氣囊的呼吸道炎癥[1-2]。種母雞感染后，病原可以通過血液從呼吸道傳播到輸卵管，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量和孵化率降低，種蛋品質(zhì)下降。MG 可在雞群中長(zhǎng)期存在和蔓延，并可通過種蛋傳播給下一代[3-5]。該病流行于全世界雞場(chǎng)中，給家禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[6]。

已普遍存在MG 流行的國家，很難通過凈化根除本病[7]。目前國內(nèi)控制MG 感染的主要措施是藥物防治和疫苗接種。抗菌藥物已被證明可以控制支原體的經(jīng)卵傳播，減少臨床癥狀和病變的出現(xiàn)[8]。用于防治MG 的藥物主要有喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和截短側(cè)耳素類[8-9]。臨床治療時(shí)，通過耐藥性檢測(cè)來選擇敏感藥物防治，可最大限度地提高藥物的治療效果和降低耐藥性產(chǎn)生。

目前關(guān)于抗菌藥物對(duì)MG 治療效果評(píng)價(jià)方法的報(bào)道，主要是對(duì)MG 引起的雛雞呼吸道癥狀的治療效果評(píng)價(jià)，而對(duì)種雞感染MG 引起的產(chǎn)蛋和孵化率下降的治療效果評(píng)價(jià)卻很少。PCR 檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速等優(yōu)點(diǎn)，適合MG 的感染率調(diào)查。但由于雞胚樣品中MG 含量極低，普通PCR 往往檢不出來，而套式PCR 檢測(cè)支原體具有更高的特異性[10]。

山東省某大型AA 父母代肉種雞場(chǎng)飼養(yǎng)的肉雞，在大約44 周齡時(shí)，出現(xiàn)產(chǎn)蛋率和孵化率降低以及雛雞1 周內(nèi)出現(xiàn)較高比例的呼吸道癥狀，至46 周齡時(shí)，該情況仍無明顯改善，后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診為MG 感染，并分離鑒定出1 株MG，命名為ZBMG01[11]。該種雞場(chǎng)的MG 控制方案為產(chǎn)蛋期每隔1～1.5 個(gè)月，用泰妙菌素飲水凈化1 次。

本研究選擇套式PCR 檢測(cè)種蛋或孵化后期死胚的MG 感染率，來評(píng)定種雞的藥物治療效果，以期為種雞場(chǎng)MG 感染和防控效果評(píng)價(jià)模式的建立提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

MG 培養(yǎng)用支原體培養(yǎng)基，參照現(xiàn)行《中國獸藥典》（三部）上規(guī)定方法進(jìn)行改良配制而成；2×TaqMaster Mix，購自Biomiga 公司；基因組DNA 提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；雞毒支原體S6 株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；7～9日齡SPF 雞胚，購自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；抗菌藥物配制，參照文獻(xiàn)[11]方法；10%恩諾沙星和45%泰妙菌素，由拜耳（中國）有限公司提供。

1.2 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

支原體MIC 測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[12-13]。將MG 分離株ZBMG01 傳至3～5 代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)物，用培養(yǎng)基稀釋至104CFU/mL，作為檢測(cè)用菌液?？咕幬镉?6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，使用支原體培養(yǎng)基進(jìn)行2 倍連續(xù)稀釋，使質(zhì)量濃度為7.875×10-3～8.000×101μg/mL。于每個(gè)孔倍比稀釋的抗菌藥液中，加入同等劑量稀釋至104CFU/mL的菌液。同時(shí)，設(shè)生長(zhǎng)對(duì)照孔（不加抗菌藥物的接種物）、終點(diǎn)對(duì)照（pH6.8 的空白培養(yǎng)基）和無菌對(duì)照（pH7.8 的無菌培養(yǎng)基）。將平板在37 ℃ 5%CO2的濕潤(rùn)二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至生長(zhǎng)組和終點(diǎn)對(duì)照具有相同的顏色。將引起無顏色變化的最小藥物濃度定義為MIC。

1.3 藥物對(duì)比治療

該種雞場(chǎng)發(fā)病后6 周內(nèi)，病情無緩和。根據(jù)MIC 測(cè)定結(jié)果，選用10%恩諾沙星和45%泰妙菌素進(jìn)行對(duì)比治療。將同一飲水系統(tǒng)下的雞群作為1個(gè)單位，分為3 組：恩諾沙星治療組，10 mg/kg（體質(zhì)量）飲水，連用5 d；泰妙菌素治療組，25 mg/kg（體質(zhì)量）飲水，連用5 d；對(duì)照組，未用藥物治療。各組取5 d 后的未上孵種蛋以及上孵后孵化后期死胚各30 枚送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。藥物對(duì)比治療后，調(diào)查種蛋孵化率。

1.4 套式PCR 檢測(cè)

1.4.1 基因組DNA 提取

1.4.1.1 雞胚中細(xì)菌基因組DNA 提取 使用試劑盒提取。無菌采集送檢雞胚和10 枚7～9日齡SPF 胚的2～4 g 卵黃囊（附帶少量卵黃），加入到3 mL PBS 中，于4 ℃浸泡12～24 h；搖勻后，取1.5 mL 浸泡液勻漿，12 000 r/min 離心10 min，棄上清液；將沉淀采用DNA 提取試劑盒提取DNA。

1.4.1.2 MG 菌株DNA 提取 MG 分離株ZBMG01和標(biāo)準(zhǔn)株S6 的模板DNA，采用水煮法提取，具體提取方法參考文獻(xiàn)[14]。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)與合成 參考文獻(xiàn)[15]，利用DNAstar 軟件，對(duì)GenBank 中的MGmgc2基因序列進(jìn)行同源性分析，然后根據(jù)MG S6 株（登錄號(hào)CP006916.2）基因保守區(qū)域，合成2 對(duì)引物（表1）。

表1 引物信息

1.4.3 套式PCR 反應(yīng)條件 外套引物擴(kuò)增反應(yīng)體系為25.0 μL，其組分為：2×TaqMaster Mix 10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，模板1.0 μL，加水補(bǔ)齊至25.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。內(nèi)套引物擴(kuò)增反應(yīng)體系為25.0 μL，其組分為：2×TaqMaster Mix 10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各1.0 μL，模板（外套PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1.0 μL）1.0 μL，加水補(bǔ)齊至25.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.4.4 套式PCR 電泳及序列測(cè)定 反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR 產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將ZBMG01 株和標(biāo)準(zhǔn)株S6 內(nèi)套引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后送大連寶生物公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果利用NCBI 網(wǎng)站的BLAST 軟件進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

MIC 結(jié)果見表2。MIC ≤5 μg/mL 的藥物從低到高分別是四環(huán)素類中的沃尼妙林（雙萜烯類）、強(qiáng)力霉素（四環(huán)素類）、泰妙菌素（雙萜烯類）、恩諾沙星（氟奎諾酮類）、大觀霉素（氨基糖苷類）、泰樂菌素（大環(huán)內(nèi)酯類）和氟苯尼考（氯霉素類）。MIC ≥20 μg/mL 的藥物從高到低分別是替米考星（大環(huán)內(nèi)酯類）、阿奇霉素（大環(huán)內(nèi)酯類）、丁胺卡那霉素（氨基糖苷類）和林可霉素（林可酰胺類）。

2.2 套式PCR 檢測(cè)

2.2.1 套式PCR 電泳及序列測(cè)定 MG ZBMG01株和S6 株經(jīng)外套引物擴(kuò)增，獲得預(yù)期大小為738 bp的片段；以外套引物擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行內(nèi)套引物PCR 擴(kuò)增，獲得預(yù)期大小為212 bp 片段（圖2）。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果于NCBI 網(wǎng)站利用BLAST 軟件進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與GenBank 登錄的MG S6 株（登錄號(hào)CP006916.3）同源性為100%。對(duì)從10 枚7～9日齡SPF 胚卵黃囊（附帶少量卵黃）中提取的基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果未擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶（圖3）。對(duì)送檢的雞胚進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果部分雞胚擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶（圖4）。

表2 12 種抗菌劑對(duì)抗MG 分離株ZBMG01 的MIC 單位：μg/mL

圖2 MG ZBMG01 株和S6 株內(nèi)套引物擴(kuò)增結(jié)果

圖3 SPF 胚卵黃囊樣品內(nèi)套引物檢測(cè)結(jié)果

圖4 部分樣品內(nèi)套引物檢測(cè)結(jié)果

2.2.2 套式PCR 檢測(cè) 該養(yǎng)殖場(chǎng)于發(fā)病后6 周，選用恩諾沙星和泰妙菌素進(jìn)行對(duì)比性治療，1 個(gè)療程（5 d）后，隨機(jī)抽取3 組種蛋和種蛋孵化后期死胚進(jìn)行套式PCR 檢測(cè)。結(jié)果（表3）顯示，經(jīng)泰妙菌素和恩諾沙星治療1 個(gè)療程后，并未完全清除種蛋的MG 感染，但與未治療的對(duì)照組相比，感染率明顯下降（P=0.006，＜0.01），表明兩種藥物均可有效控制MG 經(jīng)種蛋傳播。對(duì)比兩種藥物治療后未上孵種蛋和孵化后期死胚的內(nèi)套引物擴(kuò)增結(jié)果，發(fā)現(xiàn)感染率差異不顯著（P=0.391，＞0.05），表明兩種藥物治療效果相近。

3 討論

支原體體外耐藥性檢測(cè)主要是進(jìn)行MIC測(cè)定。但由于支原體生長(zhǎng)條件苛刻、現(xiàn)有培養(yǎng)方法不盡相同等原因，目前國際上還無根據(jù)MIC 檢測(cè)結(jié)果判定MG 耐藥性的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。Nhung 等[15]根據(jù)已發(fā)表文獻(xiàn)總結(jié)出幾種防治支原體抗菌藥物的MIC50值和四分位距（interquartile range，IQR），如恩諾沙星（1.48 μg/mL，IQR 0.26～11.31），泰樂菌素（0.125 μg/mL，IQR 0.015～0.330）和強(qiáng)力霉素（0.062 μg/mL，IQR 0.015～0.200）等。本研究將ZBMG01 株測(cè)定的MIC 與文獻(xiàn)[10，15]公布的禽支原體對(duì)常用抗菌藥物的MIC50進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)泰妙菌素、沃尼妙林、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、大觀霉素與文獻(xiàn)公布的MIC50接近，但泰樂菌素、替米考星、林可霉素卻高于文獻(xiàn)公布的MIC50數(shù)值，甚至超出IQR 范圍。

體外耐藥性檢測(cè)結(jié)果可反映抗菌藥物耐藥性的發(fā)展動(dòng)態(tài)，但不能代表藥物體內(nèi)真實(shí)的治療效果，而且禽支原體分離培養(yǎng)困難，生長(zhǎng)緩慢，因此體外耐藥性檢測(cè)不適合臨床應(yīng)用。本研究選擇套式PCR 檢測(cè)種蛋和孵化后期死胚的MG 感染率，來評(píng)定種雞支原體治療效果。結(jié)果顯示，種雞經(jīng)恩諾沙星和泰妙菌素治療后，種蛋MG 感染率均明顯下降；同時(shí)據(jù)調(diào)查，與未治療組相比，種蛋孵化率分別提高了13%和15%。這都表明兩種藥物對(duì)MG 治療有效且兩者治療效果相近，證明采用套式PCR 檢測(cè)種蛋或孵化后期死胚的MG 感染率，能直接、快速篩選出阻止或減少M(fèi)G 經(jīng)卵傳播的敏感藥物以及評(píng)價(jià)不同抗菌藥的治療效果。

表3 治療5 d 后所產(chǎn)種蛋和孵化后期死胚套式PCR 檢測(cè)結(jié)果

泰妙菌素對(duì)支原體感染具有非常好的療效，已廣泛用于家禽支原體感染的防治[9，16]。該種雞場(chǎng)在使用疫苗免疫接種的同時(shí)，于產(chǎn)蛋期每隔1～1.5個(gè)月，使用泰妙菌素飲水預(yù)防MG 感染，卻仍在約44 周齡時(shí)暴發(fā)了MG 感染，而參考文獻(xiàn)[11]結(jié)合本研究建立的評(píng)價(jià)方法推測(cè)該場(chǎng)種雞感染的MG對(duì)泰妙菌素敏感，未產(chǎn)生耐藥性，其暴發(fā)有可能是因?yàn)榉N雞不在免疫有效保護(hù)期內(nèi)或在藥物預(yù)防空白期內(nèi)感染。