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        豬圓環(huán)病毒2 型Cap 蛋白瓊脂擴(kuò)散試驗檢測方法的建立

        2020-09-07 09:58:42莊金秋梅建國
        中國動物檢疫 2020年9期
        關(guān)鍵詞:效價抗原特異性

        莊金秋,梅建國,張 穎,董 林,李 峰

        (1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;2.濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司,山東濱州 256600)

        豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員,常見基因型包括PCV1和PCV2。PCV1 無致病性,PCV2 具有致病性。PCV2 是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原,多發(fā)于5~16 周齡仔豬,死亡率達(dá)10%~30%,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。PCV2 包含兩個主要的閱讀框ORF1 和ORF2:ORF1 編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep 蛋白),ORF2編碼病毒唯一的核衣殼蛋白(Cap 蛋白)。Cap 蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性,適用于血清學(xué)檢測[4]。由于豬群中的PCV2 混合感染、隱性感染較為普遍,因此篩選實驗豬制備單一PCV2 血清抗體較為困難。為了解決這一問題,本試驗利用實驗室制備好的原核表達(dá)的PCV2 Cap 蛋白免疫家兔,制備出兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體,建立了Cap 蛋白效價測定的瓊脂擴(kuò)散試驗(AGP)檢測方法,為該病的臨床檢測奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        PCV2 Cap 蛋白,由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室制備并鑒定;新西蘭大耳白兔,于山東綠都生物科技有限公司實驗動物中心購置;弗氏完全佐劑和不完全佐劑、聚乙二醇20000,均購自SIGMA 公司;PCV2 Cap 蛋白IgG抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、豬瘟病毒(CSFV)IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、豬細(xì)小病毒(PPV)IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、豬偽狂犬病毒(PRV)IgG 抗體PPAELISA 檢測試劑盒、兔瘟病毒(RHDV)IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒,PCV2、CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV病毒抗原,PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清,瓊脂糖和瓊脂粉,梅花形打孔器(孔徑3 mm、孔距5 mm),均由山東綠都生物科技有限公司提供;0.85%生理鹽水、0.01 mol/L pH7.2 PBS,自制。

        1.2 方法

        1.2.1 家兔免疫 用0.01 mol/L pH7.2 的滅菌PBS,將實驗室保存的原核表達(dá)純化后的重組Cap蛋白抗原稀釋成100 μg/mL(按蛋白含量)的懸浮液,與等體積弗氏完全佐劑(CFA)混合勻漿乳化后,免疫新西蘭大耳白兔2 只,頸背部皮下多點(diǎn)注射1.0 mL/只(病毒蛋白含量為50 μg/只)。首次免疫10 d 和20 d 后,分別用1.5 倍和2 倍劑量蛋白抗原加等量弗氏不完全佐劑(IFA)勻漿乳化,背部皮下多點(diǎn)注射1.0 mL/只;加強(qiáng)免疫兩次,第3次免疫10 d 后,以與三免相同劑量抗原(100 μg/只)不加任何佐劑強(qiáng)化免疫1 次。對照組2 只新西蘭大耳白兔,每次用大腸桿菌菌液12 000 r/min 離心5 min 后的上清液,加等量滅菌0.01 mol/L pH7.2的PBS 混勻后,與試驗組家兔同時免疫,1.0 mL/只。

        1.2.2 兔抗PCV2 Cap 蛋白血清制備 實驗組及對照組兔子于第4 次免疫后10、14、21 d,分別心臟采血20 mL,置37 ℃ 1 h 后,放4 ℃冰箱過夜;12 000 r/min 離心5 min,吸取上層血清,分裝、編號,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.3 ELISA 法血清抗體效價測定

        1.2.3.1 血清效價測定 將所有制備的實驗組和對照組待檢血清,分別按照1:100、1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400 及1:12 800 稀釋后,按照PCV2 Cap 蛋白IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒使用說明書操作,檢測制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體效價。

        1.2.3.2 血清ELISA 特異性試驗 將第4 次免疫后21 d 的實驗組和對照組血清,按照1:100 稀釋后,分別應(yīng)用PCV2 Cap 蛋白IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、CSFV IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、PPV IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒、PRRSV IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、PRV IgG 抗體PPAELISA 檢測試劑盒、RHDV IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒,測定血清抗體效價。

        1.2.4 AGP 方法建立 AGP 試驗操作步驟按照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2168 號》豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗附注3 進(jìn)行。

        1.2.4.1 AGP 最佳工作條件確定 采用中間孔加純化后的PCV2 Cap 蛋白抗原(100 μg/mL),周圍孔加第4 次免疫后14 d 的血清的方法,將血清抗體按照1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64 進(jìn)行倍比稀釋,分別采用不同質(zhì)量濃度(0.8%、1.0%、1.2%)瓊脂粉和瓊脂糖、不同瓊脂平板高度(3 mm、5 mm)、不同質(zhì)量濃度高滲NaCl 溶液(8%、10%)、不同溫度(25、37 ℃)以及不同觀測時間(24、48、72 h),測定血清抗體效價,以確定最佳AGP工作條件。

        1.2.4.2 血清抗體最佳工作濃度確定 采用最佳AGP 工作條件,測定兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆血清抗體效價。試驗設(shè)立PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對照、陰性血清對照及制備的兔陰性血清對照。根據(jù)特異性沉淀線出現(xiàn)的明顯程度,確定該血清AGP 抗體效價及其最佳工作濃度。

        1.2.4.3 AGP 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)清晰沉淀線,標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔與抗原孔之間不出現(xiàn)沉淀線時,試驗成立。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間有明顯的沉淀線,被檢陽性血清與抗原孔之間也形成明顯沉淀線,且與陽性血清的沉淀線末端吻合,判為特異性沉淀線,則被檢血清判為陽性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與抗原孔之間有明顯的沉淀線,被檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線,則被檢血清判為陰性。以出現(xiàn)特異性沉淀線的抗體最高稀釋倍數(shù),作為待檢血清的AGP 抗體效價。

        1.2.5 AGP 特異性試驗 采用中間孔加制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白第4 次免疫后21d 的試驗組和對照組血清,梅花樁周圍孔加病毒抗原的方法,對應(yīng)用聚乙二醇20000 作10 倍濃縮的CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 等病毒以及PCV2 Cap 蛋白抗原進(jìn)行AGP 試驗,檢測待檢血清的特異性。

        1.2.6 AGP 穩(wěn)定性試驗

        1.2.6.1 批內(nèi)重復(fù)試驗 將第4 次免疫后14 d 的試驗組和對照組血清,分別于血清制備后7、14、28、56 d,做重復(fù)性AGP 試驗。采用中間孔加血清抗體、周圍孔加同一批次不同稀釋倍數(shù)的PCV2 Cap 蛋白(100 μg/mL)的方法,進(jìn)行重復(fù)性試驗。PCV2 Cap 蛋白稀釋倍數(shù)分別為1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256。

        1.2.6.2 批間重復(fù)試驗 將制備的3 批次試驗組血清做重復(fù)性AGP 試驗。采用中間孔加血清抗體,周圍孔加各批次不同稀釋倍數(shù)的PCV2 Cap 蛋白方法,進(jìn)行重復(fù)性試驗。PCV2 Cap 蛋白稀釋倍數(shù)同批內(nèi)重復(fù)試驗。

        1.2.7 AGP 符合率試驗 應(yīng)用制備并建立的AGP方法,對20 份PCV2 Cap 蛋白樣品進(jìn)行檢測,并與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作對照,比較檢測結(jié)果,計算兩者符合率。

        2 結(jié)果

        2.1 ELISA 法測定血清抗體效價

        PCV2 Cap 蛋白抗體PPA-ELISA 法測定血清抗體效價結(jié)果見表1??梢?,對照組血清呈現(xiàn)PCV2 抗體陰性。試驗組第4 次免疫后14 d 及21 d采血所測的血清抗體效價可高達(dá)1:12 800,各試驗組抗體效價均在1:6 400 以上,高于《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2168 號》規(guī)定的1:1 600 稀釋的抗體效價要求。3 批次兔免疫血清均可用于AGP試驗。

        表1 PCV2 Cap 蛋白抗體PPA-ELISA 法測定血清抗體效價結(jié)果

        2.2 血清ELISA 特異性試驗

        抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體ELISA 特異性試驗結(jié)果見表2。可見,最后1 次采血,即第4 次免疫后21 d 的實驗組和對照組血清CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體檢測結(jié)果均為陰性,表明所有制備的血清均表現(xiàn)出較好的特異性。

        表2 抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體ELISA特異性試驗檢測結(jié)果

        2.3 AGP 最佳工作條件試驗

        以出現(xiàn)明顯沉淀線的最高稀釋度,作為判定AGP 抗體效價的標(biāo)準(zhǔn)。表3 可見,瓊脂平板在1.0%瓊脂糖、8% NaCl、3 mm 平板高度、37 ℃下觀察72 h 為AGP 最佳工作條件。該條件下的沉淀線結(jié)果判定清晰、效價高,且節(jié)約抗原或抗體。

        2.4 血清抗體AGP 效價測定

        血清抗體AGP 效價測定結(jié)果見表4??梢?,制備的抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP 效價最高達(dá)1:32,符合并高于PCV2 Cap 蛋白 AGP 抗體效價不低于1:4 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所有3 批次免疫兔血清AGP 效價均在1:16 以上,均可用于AGP 試驗。試驗測得標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抗體效價為1:16,與制備的多克隆兔血清抗體相符,因此確定血清最佳工作濃度為血清原液。

        2.5 AGP 特異性試驗

        抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP 特異性試驗結(jié)果見表5??梢娮詈? 次采血,即第4 次免疫后21 d 的實驗組和對照組血清CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體檢測結(jié)果均為陰性,表明所有制備的血清均表現(xiàn)出較好的特異性。

        2.6 AGP 穩(wěn)定性試驗

        2.6.1 批內(nèi)重復(fù)試驗 結(jié)果(圖1)顯示,第4次免疫后14 d,試驗組血清制備后的7、14、28、56 d 測得同一批次PCV2 Cap 蛋白AGP 效價均為1:128,且特異性沉淀線清晰,對照組血清未出現(xiàn)沉淀線,表明所制備的抗PCV2 Cap 蛋白兔血清具有良好的批內(nèi)重復(fù)性。

        2.6.2 批間重復(fù)試驗 3 批次試驗組血清重復(fù)測3 次,測得同一批次PCV2 Cap 蛋白AGP 效價均為1:128,且特異性沉淀線清晰,表明所制備的抗PCV2 Cap 蛋白兔血清具有良好的批間重復(fù)性。

        2.7 符合率試驗

        20 份PCV2 Cap 蛋白樣品檢測結(jié)果見表6。用制備的抗PCV Cap 蛋白兔血清與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測,分別檢測出蛋白效價為1:64 的3 份,1:128 的17 份,二者符合率為100%。

        3 討論

        近年來,PCV2 感染率呈逐年上升趨勢,已成為危害我國養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要免疫抑制性疫病之一,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此,深入了解PCV2 的免疫學(xué)特性,早發(fā)現(xiàn)、早治療,已成為控制該病的關(guān)鍵。由于PCV2 在PK15 細(xì)胞上增殖而不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng),且目前細(xì)胞系污染嚴(yán)重,找到純凈的細(xì)胞進(jìn)行PCV2 體外培養(yǎng)十分困難,因此利用病毒特異性抗原進(jìn)行體外大量表達(dá),將表達(dá)產(chǎn)物適當(dāng)純化后作為檢測抗原,取代繁瑣的病毒培養(yǎng)、純化,具有重要意義[5-6]。本試驗以PCV2 Cap蛋白為免疫原,因其抗原成分單一,大大提高了免疫效率,也避免了用全病毒作為免疫原制備抗體過程中的大量繁瑣工作和結(jié)果的不確定性。依據(jù)Cap蛋白是PCV2 的主要結(jié)構(gòu)蛋白,能與PCV2 感染的血清產(chǎn)生特異性結(jié)合,具有中和活性的特點(diǎn),本試驗制備了抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體,對常見豬源病毒CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體進(jìn)行了檢測,結(jié)果均為陰性,表明本研究制備的多克隆抗體可用于后續(xù)PCV2 的免疫學(xué)特性研究。

        表3 不同條件下血清AGP 抗體效價結(jié)果

        表4 PCV2 Cap 蛋白抗體AGP 法測定血清抗體效價結(jié)果

        表5 抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP特異性試驗檢測結(jié)果

        圖1 PCV2 Cap 蛋白AGP 效價

        表6 抗PCV Cap 蛋白兔血清與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清符合率試驗結(jié)果

        4 結(jié)論

        本試驗應(yīng)用實驗室原核表達(dá)的PCV2 Cap 蛋白建立的AGP 檢測方法,經(jīng)特異性、穩(wěn)定性、符合率試驗,證明制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白血清效價高,且具有良好的特異性、穩(wěn)定性,與PCV2 豬陽性血清檢測結(jié)果符合率為100%,可完全替代標(biāo)準(zhǔn)抗體,用于PCV2 Cap 蛋白AGP 試驗檢測。

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