莊金秋,梅建國,張 穎,董 林,李 峰
(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院,山東濱州 256600;2.濱州貝爾凱瑞生物技術(shù)有限公司,山東濱州 256600)
豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)為圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員,常見基因型包括PCV1和PCV2。PCV1 無致病性,PCV2 具有致病性。PCV2 是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原,多發(fā)于5~16 周齡仔豬,死亡率達(dá)10%~30%,給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。PCV2 包含兩個主要的閱讀框ORF1 和ORF2:ORF1 編碼病毒復(fù)制相關(guān)蛋白(Rep 蛋白),ORF2編碼病毒唯一的核衣殼蛋白(Cap 蛋白)。Cap 蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性,適用于血清學(xué)檢測[4]。由于豬群中的PCV2 混合感染、隱性感染較為普遍,因此篩選實驗豬制備單一PCV2 血清抗體較為困難。為了解決這一問題,本試驗利用實驗室制備好的原核表達(dá)的PCV2 Cap 蛋白免疫家兔,制備出兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體,建立了Cap 蛋白效價測定的瓊脂擴(kuò)散試驗(AGP)檢測方法,為該病的臨床檢測奠定基礎(chǔ)。
PCV2 Cap 蛋白,由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室制備并鑒定;新西蘭大耳白兔,于山東綠都生物科技有限公司實驗動物中心購置;弗氏完全佐劑和不完全佐劑、聚乙二醇20000,均購自SIGMA 公司;PCV2 Cap 蛋白IgG抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、豬瘟病毒(CSFV)IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、豬細(xì)小病毒(PPV)IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、豬偽狂犬病毒(PRV)IgG 抗體PPAELISA 檢測試劑盒、兔瘟病毒(RHDV)IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒,PCV2、CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV病毒抗原,PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清及陰性血清,瓊脂糖和瓊脂粉,梅花形打孔器(孔徑3 mm、孔距5 mm),均由山東綠都生物科技有限公司提供;0.85%生理鹽水、0.01 mol/L pH7.2 PBS,自制。
1.2.1 家兔免疫 用0.01 mol/L pH7.2 的滅菌PBS,將實驗室保存的原核表達(dá)純化后的重組Cap蛋白抗原稀釋成100 μg/mL(按蛋白含量)的懸浮液,與等體積弗氏完全佐劑(CFA)混合勻漿乳化后,免疫新西蘭大耳白兔2 只,頸背部皮下多點(diǎn)注射1.0 mL/只(病毒蛋白含量為50 μg/只)。首次免疫10 d 和20 d 后,分別用1.5 倍和2 倍劑量蛋白抗原加等量弗氏不完全佐劑(IFA)勻漿乳化,背部皮下多點(diǎn)注射1.0 mL/只;加強(qiáng)免疫兩次,第3次免疫10 d 后,以與三免相同劑量抗原(100 μg/只)不加任何佐劑強(qiáng)化免疫1 次。對照組2 只新西蘭大耳白兔,每次用大腸桿菌菌液12 000 r/min 離心5 min 后的上清液,加等量滅菌0.01 mol/L pH7.2的PBS 混勻后,與試驗組家兔同時免疫,1.0 mL/只。
1.2.2 兔抗PCV2 Cap 蛋白血清制備 實驗組及對照組兔子于第4 次免疫后10、14、21 d,分別心臟采血20 mL,置37 ℃ 1 h 后,放4 ℃冰箱過夜;12 000 r/min 離心5 min,吸取上層血清,分裝、編號,-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.3 ELISA 法血清抗體效價測定
1.2.3.1 血清效價測定 將所有制備的實驗組和對照組待檢血清,分別按照1:100、1:800、1:1 600、1:3 200、1:6 400 及1:12 800 稀釋后,按照PCV2 Cap 蛋白IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒使用說明書操作,檢測制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體效價。
1.2.3.2 血清ELISA 特異性試驗 將第4 次免疫后21 d 的實驗組和對照組血清,按照1:100 稀釋后,分別應(yīng)用PCV2 Cap 蛋白IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、CSFV IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、PPV IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒、PRRSV IgG 抗體PPA-ELISA 檢測試劑盒、PRV IgG 抗體PPAELISA 檢測試劑盒、RHDV IgG 抗體ELISA 檢測試劑盒,測定血清抗體效價。
1.2.4 AGP 方法建立 AGP 試驗操作步驟按照《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2168 號》豬圓環(huán)病毒2 型基因工程亞單位疫苗附注3 進(jìn)行。
1.2.4.1 AGP 最佳工作條件確定 采用中間孔加純化后的PCV2 Cap 蛋白抗原(100 μg/mL),周圍孔加第4 次免疫后14 d 的血清的方法,將血清抗體按照1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64 進(jìn)行倍比稀釋,分別采用不同質(zhì)量濃度(0.8%、1.0%、1.2%)瓊脂粉和瓊脂糖、不同瓊脂平板高度(3 mm、5 mm)、不同質(zhì)量濃度高滲NaCl 溶液(8%、10%)、不同溫度(25、37 ℃)以及不同觀測時間(24、48、72 h),測定血清抗體效價,以確定最佳AGP工作條件。
1.2.4.2 血清抗體最佳工作濃度確定 采用最佳AGP 工作條件,測定兔抗PCV2 Cap 蛋白多克隆血清抗體效價。試驗設(shè)立PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清對照、陰性血清對照及制備的兔陰性血清對照。根據(jù)特異性沉淀線出現(xiàn)的明顯程度,確定該血清AGP 抗體效價及其最佳工作濃度。
1.2.4.3 AGP 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間出現(xiàn)清晰沉淀線,標(biāo)準(zhǔn)陰性血清孔與抗原孔之間不出現(xiàn)沉淀線時,試驗成立。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清孔與抗原孔之間有明顯的沉淀線,被檢陽性血清與抗原孔之間也形成明顯沉淀線,且與陽性血清的沉淀線末端吻合,判為特異性沉淀線,則被檢血清判為陽性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)陽性血清與抗原孔之間有明顯的沉淀線,被檢血清與抗原孔之間不形成沉淀線,則被檢血清判為陰性。以出現(xiàn)特異性沉淀線的抗體最高稀釋倍數(shù),作為待檢血清的AGP 抗體效價。
1.2.5 AGP 特異性試驗 采用中間孔加制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白第4 次免疫后21d 的試驗組和對照組血清,梅花樁周圍孔加病毒抗原的方法,對應(yīng)用聚乙二醇20000 作10 倍濃縮的CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 等病毒以及PCV2 Cap 蛋白抗原進(jìn)行AGP 試驗,檢測待檢血清的特異性。
1.2.6 AGP 穩(wěn)定性試驗
1.2.6.1 批內(nèi)重復(fù)試驗 將第4 次免疫后14 d 的試驗組和對照組血清,分別于血清制備后7、14、28、56 d,做重復(fù)性AGP 試驗。采用中間孔加血清抗體、周圍孔加同一批次不同稀釋倍數(shù)的PCV2 Cap 蛋白(100 μg/mL)的方法,進(jìn)行重復(fù)性試驗。PCV2 Cap 蛋白稀釋倍數(shù)分別為1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256。
1.2.6.2 批間重復(fù)試驗 將制備的3 批次試驗組血清做重復(fù)性AGP 試驗。采用中間孔加血清抗體,周圍孔加各批次不同稀釋倍數(shù)的PCV2 Cap 蛋白方法,進(jìn)行重復(fù)性試驗。PCV2 Cap 蛋白稀釋倍數(shù)同批內(nèi)重復(fù)試驗。
1.2.7 AGP 符合率試驗 應(yīng)用制備并建立的AGP方法,對20 份PCV2 Cap 蛋白樣品進(jìn)行檢測,并與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作對照,比較檢測結(jié)果,計算兩者符合率。
PCV2 Cap 蛋白抗體PPA-ELISA 法測定血清抗體效價結(jié)果見表1??梢?,對照組血清呈現(xiàn)PCV2 抗體陰性。試驗組第4 次免疫后14 d 及21 d采血所測的血清抗體效價可高達(dá)1:12 800,各試驗組抗體效價均在1:6 400 以上,高于《中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2168 號》規(guī)定的1:1 600 稀釋的抗體效價要求。3 批次兔免疫血清均可用于AGP試驗。
表1 PCV2 Cap 蛋白抗體PPA-ELISA 法測定血清抗體效價結(jié)果
抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體ELISA 特異性試驗結(jié)果見表2。可見,最后1 次采血,即第4 次免疫后21 d 的實驗組和對照組血清CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體檢測結(jié)果均為陰性,表明所有制備的血清均表現(xiàn)出較好的特異性。
表2 抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體ELISA特異性試驗檢測結(jié)果
以出現(xiàn)明顯沉淀線的最高稀釋度,作為判定AGP 抗體效價的標(biāo)準(zhǔn)。表3 可見,瓊脂平板在1.0%瓊脂糖、8% NaCl、3 mm 平板高度、37 ℃下觀察72 h 為AGP 最佳工作條件。該條件下的沉淀線結(jié)果判定清晰、效價高,且節(jié)約抗原或抗體。
血清抗體AGP 效價測定結(jié)果見表4??梢?,制備的抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP 效價最高達(dá)1:32,符合并高于PCV2 Cap 蛋白 AGP 抗體效價不低于1:4 的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。所有3 批次免疫兔血清AGP 效價均在1:16 以上,均可用于AGP 試驗。試驗測得標(biāo)準(zhǔn)陽性血清抗體效價為1:16,與制備的多克隆兔血清抗體相符,因此確定血清最佳工作濃度為血清原液。
抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP 特異性試驗結(jié)果見表5??梢娮詈? 次采血,即第4 次免疫后21 d 的實驗組和對照組血清CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體檢測結(jié)果均為陰性,表明所有制備的血清均表現(xiàn)出較好的特異性。
2.6.1 批內(nèi)重復(fù)試驗 結(jié)果(圖1)顯示,第4次免疫后14 d,試驗組血清制備后的7、14、28、56 d 測得同一批次PCV2 Cap 蛋白AGP 效價均為1:128,且特異性沉淀線清晰,對照組血清未出現(xiàn)沉淀線,表明所制備的抗PCV2 Cap 蛋白兔血清具有良好的批內(nèi)重復(fù)性。
2.6.2 批間重復(fù)試驗 3 批次試驗組血清重復(fù)測3 次,測得同一批次PCV2 Cap 蛋白AGP 效價均為1:128,且特異性沉淀線清晰,表明所制備的抗PCV2 Cap 蛋白兔血清具有良好的批間重復(fù)性。
20 份PCV2 Cap 蛋白樣品檢測結(jié)果見表6。用制備的抗PCV Cap 蛋白兔血清與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測,分別檢測出蛋白效價為1:64 的3 份,1:128 的17 份,二者符合率為100%。
近年來,PCV2 感染率呈逐年上升趨勢,已成為危害我國養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要免疫抑制性疫病之一,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。因此,深入了解PCV2 的免疫學(xué)特性,早發(fā)現(xiàn)、早治療,已成為控制該病的關(guān)鍵。由于PCV2 在PK15 細(xì)胞上增殖而不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng),且目前細(xì)胞系污染嚴(yán)重,找到純凈的細(xì)胞進(jìn)行PCV2 體外培養(yǎng)十分困難,因此利用病毒特異性抗原進(jìn)行體外大量表達(dá),將表達(dá)產(chǎn)物適當(dāng)純化后作為檢測抗原,取代繁瑣的病毒培養(yǎng)、純化,具有重要意義[5-6]。本試驗以PCV2 Cap蛋白為免疫原,因其抗原成分單一,大大提高了免疫效率,也避免了用全病毒作為免疫原制備抗體過程中的大量繁瑣工作和結(jié)果的不確定性。依據(jù)Cap蛋白是PCV2 的主要結(jié)構(gòu)蛋白,能與PCV2 感染的血清產(chǎn)生特異性結(jié)合,具有中和活性的特點(diǎn),本試驗制備了抗PCV2 Cap 蛋白多克隆抗體,對常見豬源病毒CSFV、PPV、PRRSV、PRV、RHDV 抗體進(jìn)行了檢測,結(jié)果均為陰性,表明本研究制備的多克隆抗體可用于后續(xù)PCV2 的免疫學(xué)特性研究。
表3 不同條件下血清AGP 抗體效價結(jié)果
表4 PCV2 Cap 蛋白抗體AGP 法測定血清抗體效價結(jié)果
表5 抗PCV2 Cap 蛋白兔血清抗體AGP特異性試驗檢測結(jié)果
圖1 PCV2 Cap 蛋白AGP 效價
表6 抗PCV Cap 蛋白兔血清與PCV2 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清符合率試驗結(jié)果
本試驗應(yīng)用實驗室原核表達(dá)的PCV2 Cap 蛋白建立的AGP 檢測方法,經(jīng)特異性、穩(wěn)定性、符合率試驗,證明制備的兔抗PCV2 Cap 蛋白血清效價高,且具有良好的特異性、穩(wěn)定性,與PCV2 豬陽性血清檢測結(jié)果符合率為100%,可完全替代標(biāo)準(zhǔn)抗體,用于PCV2 Cap 蛋白AGP 試驗檢測。