（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

鸚鵡熱是由鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci）感染所引起的一種人獸共患病。鸚鵡熱衣原體是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭陰性菌，其發(fā)育形態(tài)有兩種：一種是能二分裂增殖的網(wǎng)狀小體，另一種是有感染能力的原生小體[1]。目前已知鸚鵡熱衣原體有9 個(gè)血清型，分別為A、B、C、D、E、F、E/B、WC 和M56 型[2]。它是一種多宿主性病原微生物，能通過(guò)呼吸道或直接接觸傳播，可感染多種鳥類和人類。目前鸚鵡熱廣泛分布于世界各地，中國(guó)、美國(guó)、巴西、日本和比利時(shí)等國(guó)家都有鳥類感染鸚鵡熱衣原體的報(bào)道[3-8]。

近年來(lái)鸚鵡熱衣原體作為鳥類衣原體病和人類衣原體病的病原越來(lái)越受到重視，研究熱點(diǎn)多集中在如何防止家禽感染以及感染后的治療措施方面。對(duì)于該病的診斷大多集中在細(xì)胞培養(yǎng)、PCR或基因芯片等[9]，而受病原分離培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)室條件等的限制，很多方法在實(shí)際應(yīng)用中不能較好發(fā)揮作用。本研究基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的原理，針對(duì)鸚鵡熱衣原體23SRNA 基因序列設(shè)計(jì)通用引物，建立一種恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增鸚鵡熱衣原體的方法。該方法可用恒溫?zé)晒鈨x直接檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而減少了肉眼判讀結(jié)果的誤差，既增強(qiáng)了準(zhǔn)確性，也避免了開(kāi)蓋污染產(chǎn)生假陽(yáng)性。本方法的建立為鸚鵡熱衣原體病的快速診斷、實(shí)驗(yàn)室鑒定和疫情監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和核酸DNA 根據(jù)NCBI 中的鸚鵡熱衣原體23SRNA 基因序列，運(yùn)用DNAstar 軟件進(jìn)行同源性分析和BLAST 序列分析，篩選出23SRNA 基因高度保守序列，以篩選獲得的高度保守序列作為檢測(cè)目的基因片段，合成陽(yáng)性質(zhì)粒，質(zhì)粒大小為2 781 bp，質(zhì)量濃度為32.55 ng/μL。流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和臨床DNA 樣品等的核酸DNA，由本實(shí)驗(yàn)室提取并保存。

1.1.2 主要儀器和試劑 引物和質(zhì)粒，由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成；DNA 提取試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA 公司；恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀Dhelix1610和DNA 恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，購(gòu)自廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和反應(yīng)條件 使用Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/e/）軟件設(shè)計(jì)6 組引物組合：組合1，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-1FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；組合2，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-2FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；組合3，包括CH-1OF、CH-3OB、CH-1FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；組 合4，包 括CH-1OF、CH-1OB、CH-4FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；組合5，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-1FIP、CH-5BIP、CH-1LF、CH-1LB；組合6，包括CH-6OF、CH-6OB、CH-6FIP、CH-6BIP、CH-6LF、CH-6LB（表1）。將引物進(jìn)一步通過(guò)NCBI 的BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行序列比對(duì)分析，比較設(shè)計(jì)的引物序列與主要病原菌（流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌）的序列匹配度，確定引物的特異性。

1.2.2 引物篩選 通過(guò)試驗(yàn)篩選最優(yōu)反應(yīng)條件，反應(yīng)總體系約為25 μL，其中反應(yīng)緩沖液12.5 μL、引物1 μL、聚合酶1 μL、熒光染料0.5 μL、RNase Free dH2O 8.0 μL、DNA 模板2 μL。反應(yīng)體系配好后加入甘油0.25 μL，然后63 ℃下恒溫?cái)U(kuò)增1 h。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板陽(yáng)性對(duì)照，雙蒸水作為陰性對(duì)照進(jìn)行引物篩選；陰陽(yáng)對(duì)照各做2 個(gè)重復(fù)，選取反應(yīng)條件最優(yōu)的作為最優(yōu)引物。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用1.2.2 中篩選出的最優(yōu)引物，以流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等病原菌核酸作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的特異性。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 以標(biāo)準(zhǔn)核酸為母液，將其稀釋為1×106拷貝/μL后，再連續(xù)進(jìn)行10倍倍比稀釋，依次取100～106拷貝/μL 為模板，應(yīng)用1.2.2 中篩選出的最優(yōu)引物進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)價(jià)該方法的敏感性。

表1 鸚鵡熱衣原體恒溫?zé)晒饪焖贆z測(cè)引物

1.2.5 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的34 份從雞咽喉和泄殖腔拭子中提取的DNA 樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選

本研究設(shè)計(jì)了6 組引物探針組合，先經(jīng)BLAST 比對(duì)分析，并與常見(jiàn)病原菌（流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示特異性良好。通過(guò)試驗(yàn)篩選最優(yōu)引物，結(jié)果顯示6 組引物中，組合1 起峰時(shí)間早、熒光強(qiáng)度值高、重復(fù)性和特異性最好，故組合1 最優(yōu)（圖1）。

2.2 特異性試驗(yàn)

提取流產(chǎn)衣原體、動(dòng)物布魯氏菌、牛結(jié)核分枝桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等的核酸作為模板，以標(biāo)準(zhǔn)核酸為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)引物組合1 進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果（圖2）顯示，引物組合1 特異性較好。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

取原濃度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，依次取100～106拷貝/μL 為模板，對(duì)稀釋后的各濃度梯度進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)梯度做2 次重復(fù)，結(jié)果顯示該方法的靈敏度為100 拷貝/μL（圖3）。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

用建立的方法（LAMP）與QPCR 方法同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的臨床DNA樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（圖4）顯示，34 份臨床樣品中，LAMP 和QPCR 均檢測(cè)到1 份陽(yáng)性，其余為陰性，符合率為100%。

3 討論

在我國(guó)，鸚鵡熱衣原體被列為三類動(dòng)物病原微生物，其宿主廣泛，感染性強(qiáng)，可通過(guò)呼吸道或直接接觸傳播。目前實(shí)驗(yàn)室診斷常用的方法中，雞胚培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室生物安全條件要求較高，且不易分離到病原；補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和間接血凝試驗(yàn)操作步驟比較繁瑣，容易出現(xiàn)結(jié)果偏差；熒光定量PCR 和基因芯片等試驗(yàn)則需要昂貴的儀器，成本較高。隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增技術(shù)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)和膠體金等檢測(cè)方法越來(lái)越成熟，已有很多被應(yīng)用到人獸共患病的診斷中。加強(qiáng)鸚鵡熱衣原體新型診斷技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，必將為該病的快速、高效診斷和防控奠定基礎(chǔ)。

LAMP 檢測(cè)方法是由日本科學(xué)家開(kāi)發(fā)的[11]，也被國(guó)內(nèi)很多學(xué)者應(yīng)用到各種疫病的檢測(cè)中[12-14]。但這些方法往往需要借助肉眼觀察顏色變化以及凝膠電泳實(shí)驗(yàn)或濁度儀等判讀結(jié)果，容易出現(xiàn)結(jié)果偏差，而且無(wú)法有效避免開(kāi)蓋污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性。本研究建立的基于恒溫?zé)晒饧夹g(shù)的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)診斷技術(shù)，適用于基層和現(xiàn)場(chǎng)快速篩查病原。該技術(shù)能在63 ℃恒溫條件下1 h 內(nèi)即可顯示結(jié)果，操作簡(jiǎn)單、快速，特異性強(qiáng)，靈敏度可達(dá)100 拷貝/μL。此外，該技術(shù)用國(guó)產(chǎn)儀器通過(guò)直接檢測(cè)熒光信號(hào)判讀結(jié)果，既增強(qiáng)了準(zhǔn)確性，也避免了開(kāi)蓋污染產(chǎn)生假陽(yáng)性。該方法的建立彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)的不足，也為實(shí)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體的現(xiàn)場(chǎng)快速診斷提供了技術(shù)支持。應(yīng)用建立的LAMP 方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的臨床DNA 樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與QPCR 檢測(cè)的結(jié)果相同，說(shuō)明該方法可用于臨床檢測(cè)。

圖1 衣原體6 組引物篩選結(jié)果

圖2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

圖4 部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果