（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（青島），山東青島 266032）

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是腸桿菌科（Enterobactericaeae）中寄生于恒溫動(dòng)物消化道下段、兼性厭氧的革蘭氏陰性桿狀細(xì)菌，但在特定情況下可致病：一類(lèi)是細(xì)菌寄生部位發(fā)生改變，成為機(jī)會(huì)致病菌；另一類(lèi)是致瀉性大腸桿菌，可引起嬰幼兒與成年人細(xì)菌性腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等。根據(jù)毒力因子和發(fā)病機(jī)制不同，可將致瀉性大腸桿菌分為5 類(lèi)：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（EnterotoxigenicE.coli，ETEC），腸致瀉性大腸桿菌（EnteropathogenicE.coli，EPEC），腸出血性大腸桿菌（EnterohemorrhagicE.coli，EHEC），腸侵襲性大腸桿菌（EnteroinvasiveE.coli，EIEC）和腸聚集性大腸桿菌（EnteroaggregativeE.coli，EAEC）[1]。

在過(guò)去的40年內(nèi)，較為嚴(yán)重的致瀉性大腸桿菌感染事件均是通過(guò)食物傳播引起的。例如，美國(guó)多次暴發(fā)的與肉餡有關(guān)的O157:H7食物中毒事件，日本1996年暴發(fā)的與進(jìn)食牛肉有關(guān)的大腸桿菌疫情，2020年我國(guó)貴州省一所學(xué)校發(fā)生的200 多名學(xué)生大腸桿菌食物中毒事件?？梢?jiàn)，致瀉性大腸桿菌在食源性疾病中扮演著重要角色，目前已成為各國(guó)畜禽產(chǎn)品致病微生物監(jiān)測(cè)和控制的重點(diǎn)。豬肉是我國(guó)廣大居民最主要的動(dòng)物源性食品，而生豬屠宰環(huán)節(jié)是肉品受致病菌污染的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)之一。因此，及時(shí)監(jiān)控生豬屠宰環(huán)節(jié)中致瀉性大腸桿菌污染情況，對(duì)控制其傳播、降低食品安全隱患具有重要意義[2]。

為了解我國(guó)不同地區(qū)生豬肉品中致瀉性大腸桿菌的污染情況及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，本研究對(duì)近幾年分離自華北、華東、華中及西南4 個(gè)地區(qū)生豬屠宰環(huán)節(jié)的283 株大腸桿菌進(jìn)行了致瀉特性鑒定，并通過(guò)2b-RAD 測(cè)序，對(duì)陽(yáng)性致瀉菌進(jìn)行分型分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源 近幾年分離自華北、華東、華中及西南4 個(gè)地區(qū)豬屠體表面拭子的283 株大腸桿菌，其中華北地區(qū)60 株、華東地區(qū)123 株、華中地區(qū)74 株、西南地區(qū)26 株，以上菌株均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心致病微生物監(jiān)測(cè)室分離、鑒定和保存。5 種致瀉性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心饋贈(zèng)。

1.1.2 主要儀器與試劑 冷凍離心機(jī)：購(gòu)自艾本德（上海）國(guó)際貿(mào)易有限公司；水浴鍋：購(gòu)自天津泰斯特儀器有限公司；PCR 擴(kuò)增儀：購(gòu)自杭州博日科技有限公司；電泳儀：購(gòu)自伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)：購(gòu)自上海天能科技有限公司。2×TaqMaster Mix：購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖：購(gòu)自西班牙Biowest 公司；DL2000 DNA Marker：購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯：購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；5 種致瀉性大腸桿菌多重PCR 鑒定試劑盒：來(lái)自中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心致病微生物監(jiān)測(cè)室（生產(chǎn)批次20190917，有效期1年）。

1.2 方法

1.2.1 致瀉性大腸桿菌多重PCR 鑒定 本次檢測(cè)的5 種致瀉類(lèi)型和相應(yīng)的毒力基因分別為：ETEC-est/elt、EPEC-eae、EHEC-eae+stx、EAECaggR、EIEC-ipaH。采用煮沸法提取283 株待檢菌株的DNA 模板，PCR 反應(yīng)體系為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL、混合引物1 μL、DNA 模板1 μL、去離子水10.5 μL。引物序列及混合方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[3]。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。配制2.5%濃度的瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR 產(chǎn)物于加樣孔中，120 V 電泳30 min，在凝膠成像分析儀中觀察電泳結(jié)果。

1.2.2 2b-RAD 測(cè)序 挑取致瀉性大腸桿菌單菌落接種至2 mL 胰蛋白胨大豆肉湯中，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)18 h；每株陽(yáng)性菌各吸取200 μL 送至青島歐易生物科技有限公司進(jìn)行2b-RAD 測(cè)序。

1.2.3 序列分析 利用軟件Structure（Verison 2.3.4），對(duì)所有測(cè)序個(gè)體進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)聚類(lèi)分析；利用軟件Treebest（Version 1.9.2），將獲得的序列構(gòu)建NJ（Neighbor-Joining）樹(shù)，樹(shù)的可靠性通過(guò)bootstrap 法進(jìn)行檢驗(yàn)（重復(fù)1 000 次）。

2 結(jié)果與分析

2.1 致瀉性大腸桿菌鑒定

5 種致瀉類(lèi)型和6 種毒力基因的PCR 陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)圖1。本試驗(yàn)共從283 株大腸桿菌中鑒定出36株致瀉性大腸桿菌，陽(yáng)性檢出率為12.72%。其中，西南地區(qū)最高，為26.92%（7/26），華東地區(qū)最低，為10.57%（13/123）。這36 株致瀉性大腸桿菌中，ETEC、EPEC、EAEC 占比較高，分別為33.33%、30.56%、25.00%；而EHEC、EIEC 占比較小，均為5.56%。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 種群結(jié)構(gòu)分析

利用軟件Structure（Verison 2.3.4），對(duì)所有測(cè)序個(gè)體進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)聚類(lèi)。為挑選合適的N（軟件內(nèi)部稱(chēng)之為K值），依次設(shè)置不同的N值進(jìn)行多次計(jì)算[4]。這里，N值依次選用了3～10 之間的整數(shù)，每個(gè)N值做3 次重復(fù)。根據(jù)變化曲線(xiàn)，最終選擇N=8 時(shí)的結(jié)果作為種群分析結(jié)果。分群結(jié)果（圖2）顯示，研究群體推斷由8 個(gè)亞群組成，即這36 株致瀉性大腸桿菌可分為8 個(gè)亞群。

2.3 系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)分析

圖1 5 種致瀉類(lèi)型和6 種毒力基因的PCR 結(jié)果

表1 不同地區(qū)致瀉性大腸桿菌檢出情況

圖2 36 株致瀉性大腸桿菌的種群結(jié)構(gòu)聚類(lèi)圖

圖3 36 株致瀉性大腸桿菌的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)

將獲得的序列利用軟件Treebest（Version 1.9.2），構(gòu)建NJ（Neighbor-Joining）樹(shù)，并對(duì)樹(shù)的可靠性通過(guò)bootstrap 法進(jìn)行檢驗(yàn)（重復(fù)1 000 次）[5]。結(jié)果（圖3）顯示：第一，親緣關(guān)系較近菌株的致瀉類(lèi)型基本一致，如1、3、5 均為EAEC，13、14均為ETEC，219、280 均為EPEC；第二，親緣關(guān)系較近菌株的分離時(shí)間大都比較接近，如1、3、5均分離自2008年，80、141、143、196、207 分離自2010—2012年；第三，來(lái)自同一地區(qū)菌株的親緣關(guān)系相對(duì)較近，如49、50、51、52 均來(lái)自華北地區(qū)，141、143、196、207 均來(lái)自西南地區(qū)。通過(guò)與圖2 比較發(fā)現(xiàn)，以上結(jié)果與種群聚類(lèi)結(jié)果基本一致。

3 討論

大腸桿菌廣泛存在于自然界和動(dòng)物腸道。本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)評(píng)估發(fā)現(xiàn)，生豬屠宰環(huán)節(jié)的大腸桿菌污染，特別是致瀉性大腸桿菌污染，是危害肉品安全的主要風(fēng)險(xiǎn)之一。通過(guò)致瀉性大腸桿菌的多重PCR 鑒定及2b-RAD 序列分析，可以更加了解我國(guó)不同地區(qū)生豬肉品中致瀉性大腸桿菌的污染情況及彼此間的親緣關(guān)系，為精準(zhǔn)防控生豬屠宰環(huán)節(jié)致瀉性大腸桿菌污染，保障肉品衛(wèi)生安全提供了科學(xué)數(shù)據(jù)和技術(shù)支撐。

目前，用于鑒定致瀉性大腸桿菌的檢測(cè)方法有多種，如動(dòng)物試驗(yàn)、血清型鑒定、毒力基因測(cè)定等。其中：動(dòng)物試驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，如動(dòng)物選擇不合適或菌株毒力不夠強(qiáng)等，均可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不可信；血清型鑒定費(fèi)用高、敏感性低，且血清來(lái)源和質(zhì)量以及菌體表面的其他抗原也會(huì)影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度[6]；基于不同毒力基因的PCR檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單高效、準(zhǔn)確特異等優(yōu)點(diǎn)，但單基因PCR 一次只能檢測(cè)一種毒力基因或病原，當(dāng)需要檢測(cè)多種基因時(shí)就費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本增加。本試驗(yàn)采用的多重PCR 檢測(cè)方法可高通量測(cè)定6 個(gè)毒力基因，一次性區(qū)別5 種致瀉性大腸桿菌，大大節(jié)約了試驗(yàn)時(shí)間和成本，且本方法與單基因PCR 鑒定和血清型鑒定的符合率均為100%[3，7]。

本研究從283 株大腸桿菌中共鑒定出36 株致瀉性大腸桿菌，檢出率為12.72%，其中西南地區(qū)檢出率（26.92%）高于其他幾個(gè)地區(qū)，與張敏等[8]得出的四川省致瀉性大腸桿菌檢出率（29.6%）相似。這可能與當(dāng)?shù)厣i屠宰場(chǎng)硬件設(shè)施配備不足、衛(wèi)生控制措施執(zhí)行不嚴(yán)、冷鏈設(shè)施覆蓋率不高、微生物相關(guān)檢測(cè)開(kāi)展不普遍有關(guān)。對(duì)于致瀉性大腸桿菌檢出率較高的地區(qū)，應(yīng)當(dāng)特別注意其預(yù)防和控制，以有效保障肉品衛(wèi)生安全。本研究發(fā)現(xiàn)，在5 種致瀉類(lèi)型中，ETEC、EPEC、EAEC 占比較高，表明我國(guó)屠宰生豬肉品中污染的致瀉性大腸桿菌以這3種類(lèi)型為主。

針對(duì)病原建立高效準(zhǔn)確的追溯技術(shù)和分型方法，對(duì)于預(yù)防和控制病原菌引起相關(guān)疾病具有重要的意義。目前常用的大腸桿菌分型方法有表型分型和分子分型兩大類(lèi)。表型分型成本低、操作簡(jiǎn)單，不需要大型儀器設(shè)備[9]，因此在基層應(yīng)用比較廣泛[10]。但其結(jié)果容易受培養(yǎng)條件及菌體狀況影響，還需其他方法補(bǔ)充驗(yàn)證[11]。分子分型方法比較常用的有脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)（PFGE）、多位點(diǎn)序列分析（MLST）等，但PFGE 在色譜圖上只能反映片段的尺寸和數(shù)目，兩個(gè)序列不同的片段可能分子量相似，因此可能出現(xiàn)假陽(yáng)性。此外，如果試驗(yàn)中使用不同的限制性?xún)?nèi)切酶，得到的電泳圖譜也會(huì)有一定的差異[12]。而MLST 方法運(yùn)用了高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)，重復(fù)性好、分辨率較高，但不適用于管家基因無(wú)變異或變異較低的菌株。2b-RAD 是一種新型的分子分型技術(shù)，它利用IIB 型限制性?xún)?nèi)切酶，通過(guò)基因組酶切產(chǎn)生等長(zhǎng)的33～36 bp 的酶切標(biāo)簽。這些標(biāo)簽經(jīng)過(guò)富集后用于下游的高通量測(cè)序反應(yīng)，通過(guò)生物信息學(xué)分析實(shí)現(xiàn)全基因組范圍高通量SNP 篩查和分型分析[13-14]，保證了每個(gè)標(biāo)記的可靠性和準(zhǔn)確性。

本研究檢出的陽(yáng)性致瀉菌株經(jīng)2b-RAD 測(cè)序、種群結(jié)構(gòu)聚類(lèi)分析，發(fā)現(xiàn)36株菌株可分為8個(gè)亞群，同一亞群的菌株親緣關(guān)系較近。經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)：第一，親緣關(guān)系較近菌株的致瀉類(lèi)型基本一致；第二，親緣關(guān)系較近菌株分離時(shí)間大都比較接近；第三，來(lái)自同一地區(qū)菌株的親緣關(guān)系相對(duì)較近。由此可見(jiàn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果與種群聚類(lèi)結(jié)果基本一致。但也有例外，這是因?yàn)榇竽c桿菌毒力基因眾多，在漫長(zhǎng)的細(xì)菌進(jìn)化過(guò)程中，質(zhì)粒等可移動(dòng)元件會(huì)發(fā)生水平轉(zhuǎn)移[15-16]，其毒力基因也可以重組，使得致瀉類(lèi)型發(fā)生改變。綜上，生豬屠宰環(huán)節(jié)致瀉性大腸桿菌的流行分布有一定的地域差異，且其親緣關(guān)系呈一定的時(shí)空特異性。