韓 涌，王 濤，張 震，劉文偉

（1.烏魯木齊市動物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063；2.新疆農(nóng)業(yè)大學，新疆烏魯木齊 830091）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）屬于正黏病毒科A 型流感病毒，根據(jù)其粒子表面抗原血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的不同，可分為不同亞型。目前已發(fā)現(xiàn)有18 種HA 亞型和11種NA 亞型[1]，其中H1—H16、N1—N9 各亞型流感病毒均可在禽類中分離到，而其他亞型毒株來源于蝙蝠[2]。根據(jù)病毒致病性不同，可將AIV 分為高致病性、低致病性和無致病性[3]。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將高致病性禽流感列為須通報動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[4]。

H9N2亞型禽流感1994年首次暴發(fā)于廣東省，后逐漸擴散至我國其他區(qū)域，并成為我國家禽中流行的主要亞型[5-6]。AIV 還可感染包括犬、貓[7]、豬[8]和雪貂[9]在內(nèi)的多種哺乳動物。1998年，我國報道了首例人H9N2 亞型禽流感病例[10]；1997年5月，我國香港首次報道發(fā)生了H5N1 亞型AIV 傳染人并引起死亡的事件[11]。因此，AIV 嚴重影響了全世界養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展，并對人類健康構成了威脅。

研究[12]表明，活禽交易市場是AIV 向外傳播的主要來源地。烏魯木齊市活禽交易市場禽類交易頻繁，活禽來源較為分散，本地活禽交易量較小；市場內(nèi)活禽種類繁多，且長期密切接觸；市場環(huán)境高濕，環(huán)境消毒不及時、不徹底。這些都為病毒傳播提供了有利條件[13]，也導致交易市場成為AIV跨物種傳播的重要環(huán)節(jié)[14-15]。冬季是禽流感高發(fā)季節(jié)。為了解冬季新疆烏魯木齊市活禽市場交易活禽的AIV 感染情況，以便采取措施降低AIV 通過活禽交易市場向外傳播以及感染人的風險，2019年11月至2020年1月開展了本次調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 柱式RNA 核酸提取試劑盒（批號YRNA-TQ 20190926P）、AIV 通用型熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒（批號AIV20191018P），均由哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司提供；H5、H7 和H9 亞型AIV 三重熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒（批號60050），深圳澳東檢驗檢測有限公司提供；AI-H5（Re11）株抗原（批號20191012）、陽性血清（批號20191011）、AI-H5（Re12）株抗原（批號20190828）、陽性血清（批號20190925）；AI-H7（Re2）株抗原（批 號201900416）、陽性血清（批號20180901）、陰性血清（批號20180426），均購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要儀器 高速冷凍離心機（型號3K15），購自德國Sigma 公司；實時熒光定量PCR 儀（型號QuantStudio 5），購自美國賽默飛公司；電熱式恒溫水浴鍋（型號DM0421），購自北京市醫(yī)療設備有限公司；可調(diào)式漩渦振蕩器（型號MX-S），購自大龍器械有限公司；瞬時離心機（型號MinX-5），購自美國ABI 公司。

1.1.3 樣本 血清樣本：用2.5 mL 一次性采血器采集2 mL 全血，一一對應編號，放至室溫自然析出血清，用1.5 mL 離心管收集淡黃色清亮血清，共采集85 份血清樣本。棉拭子樣本：采集交易活禽的泄殖腔/咽喉棉拭子（103 份）和2 個大型活禽運輸車輛出入通道環(huán)境拭子（40 份），共143份。將采集的樣本放入裝有冰袋的采樣箱內(nèi)送至實驗室。本次調(diào)查所采集的樣品于2019年11月至2020年1月分3 次采集，具體信息見表1。

表1 血清樣品來源及采集時間

1.2 方法

1.2.1 免疫抗體檢測 按照標準GB/T 18936—2003 中的血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗方法，分別檢測活禽血清樣本的H5（Re-11）、H5（Re-12）、H7（Re-2）AIV 抗體?？贵w效價≥log24為免疫免疫抗體合格。

1.2.2 核酸檢測

1.2.2.1 樣品滅活 將采集的棉拭子樣品放入恒溫水浴鍋中56 ℃ 30 min 滅活。

1.2.2.2 核酸提取 將水浴鍋中的棉拭子取出，置于振蕩器充分震蕩；參照柱式RNA 核酸提取試劑盒說明書進行RNA 核酸提取，將提取后的核酸放至-20 ℃保存待檢測。

1.2.2.3 核酸檢測 將提取的RNA 核酸，參照AIV 通用型熒光定量RT-PCR 檢測劑盒說明書進行檢測。

1.2.2.4 核酸分型 將通用型AIV 核酸檢測為陽性的核酸，參照H5、H7 和H9 亞型AIV 三重熒光定量RT-PCR 檢測試劑盒進行分型，對陰性樣品定義為未分型。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫抗體檢測

85 份活禽血清樣本中，H5（Re-11）株免疫抗體合格50 份，合格率為58.8%；H5（Re-12）株免疫抗體合格52 份，合格率為61.2%；H7（Re-2）株免疫抗體合格54 份，合格率為63.5%。由圖1 可以看出，市場交易活禽流感免疫抗體水平普遍不高，低于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求的70%的最低標準，抗體效價大部分低于log24，且免疫抗體合格樣品效價也臨近臨界值，效價點密集分布在 log23～log25之間。

圖1 85 份血清樣品的禽流感免疫抗體效價分布

2.2 病毒核酸檢測

2.2.1 活禽棉拭子核酸檢測 在采集的雞、鴨、鵝、鴿4 種禽類103 份活禽泄殖腔/咽喉棉拭子中，檢出AIV 核酸陽性29 份，陽性率為28.15%。各種禽類樣品的檢測結(jié)果及PCR 檢測結(jié)果分別見表2、圖2。從表2 可以看出，鵝和鴨陽性率較高，雞和鴿子較低，說明水禽的AIV 感染率較高。該結(jié)果符合禽流感的流行病學特征。從圖2 可以看出，活禽棉拭子核酸陽性較強，出現(xiàn)S 形曲線的Ct 值較小，熒光信號出現(xiàn)較早，表明樣品質(zhì)量能夠滿足試驗要求。

表2 活禽泄殖腔/咽喉棉拭子AIV 核酸檢測結(jié)果

2.2.2 外環(huán)境AIV 核酸檢測 在2 個開放通道采集的40 份環(huán)境棉拭子中，檢出AIV 核酸陽性7 份，陽性率為17.5%。PCR 陽性檢測結(jié)果見圖3。這說明2 個開放式通道雖然通風效果較好，但依然存在AIV 污染。

圖2 活禽泄殖腔/咽喉棉拭子AIV 核酸熒光PCR 檢測結(jié)果

圖3 活禽交易區(qū)外環(huán)境AIV 核酸熒光PCR 檢測結(jié)果

2.3 核酸分型

36 份AIV 核酸陽性樣品，經(jīng)H5、H7 和H9亞型三重熒光定量RT-PCR 檢測，檢出H5 亞型3份，陽性率為8.33%；H9 亞型22 份，陽性率為61.11%；未定型11 份，陽性率為30.56%。具體結(jié)果詳見表2、圖4～5。從表2 可以看出，活禽市場內(nèi)的交易活禽以感染H9 亞型AIV 為主，占比61.11%；H5 亞型次之，占比8.33%，H7 亞型最低，為0。從活禽種類來看，鴨、鵝等水禽以感染H9亞型AIV 為主。市場通道環(huán)境中，未檢出H5、H7和H9 亞型病毒。

3 討論

3.1 交易活禽流感免疫抗體情況

H5、H7 亞型禽流感屬于國家強制免疫的重大動物疫病，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的整體免疫抗體合格率需≥70%，免疫密度≥95%。2019年下半年開始，烏魯木齊市用新的H5（Re-11、Re-12）+H7（Re-2）三價苗進行強制免疫。但從此次調(diào)查結(jié)果來看，交易活禽的免疫抗體水平普遍較低。其原因可能有以下兩點：一是養(yǎng)殖場戶忽視對即將進入交易環(huán)節(jié)活禽的H5、H7 亞型禽流感免疫；二是部分養(yǎng)殖戶仍使用庫存的未更新毒株的禽流感疫苗免疫，而此次檢測的是新毒株疫苗的免疫抗體。

表3 不同類型樣本禽流感病毒核酸分型情況比較

圖4 H5 亞型AIV 核酸熒光PCR 檢測結(jié)果

圖5 H9 亞型AIV 核酸熒光PCR 檢測結(jié)果

3.2 交易市場內(nèi)部活禽AIV 污染狀況

對不同禽類的AIV 核酸檢測結(jié)果顯示，鴨和鵝等水禽的陽性率較高，而雞最低，這與鴨和鵝等水禽是AIV 自然宿主這一結(jié)論一致[16]，也提示活禽市場需加強對水禽的禽流感防控[17]。AIV 各亞型核酸檢測結(jié)果顯示，H5 亞型陽性率為8.33%，H9 亞型為61.11%，未檢出H7 亞型，這與目前流行于我國的AIV 主要是H5 和H9 亞型的結(jié)論一致[18-19]。

3.3 交易市場內(nèi)部活禽管理情況

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該活禽市場環(huán)境濕度較高，活禽來源分散，存放密度較大，這為病毒傳播提供了有利條件。此外，各檔口存留活禽仍放在市場交易區(qū)，無法實現(xiàn)活禽“零過夜”。這將造成病毒在環(huán)境中持續(xù)存在，從而為病毒重配產(chǎn)生新的病毒亞型提供了條件。

據(jù)調(diào)查[20]，活禽交易市場內(nèi)活禽運輸車、活禽檔口以及活禽屠宰點3 個主要環(huán)節(jié)AIV 核酸污染狀況較嚴重，是市場防控AIV 流行的關鍵風險點。結(jié)合本次調(diào)查的進入市場活禽H5、H7 免疫抗體水平低而H5、H9 亞型禽流感污染狀況較嚴重，提示應做好以下工作：加大活禽交易市場監(jiān)管力度，每天清洗消毒，包括市場內(nèi)和進出市場的通道，堅持“一日一清洗、一周一消毒、一周一休市、活禽零過夜”的市場管理制度；重點加強水禽監(jiān)測，杜絕水禽和陸禽混合交易；在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，加強禽流感免疫，提高禽流感的免疫保護水平。

4 結(jié)論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該交易市場交易活禽和對外通道中都存在比較嚴重H9 和H5 亞型AIV 污染，且交易活禽H5、H7 禽流感免疫抗體水平較低，已不能起到有效的保護作用，因而需要通過加強市場監(jiān)管和清洗消毒，來降低市場內(nèi)禽流感疫情的暴發(fā)和散播風險。