蔣如如， 魏 靜， 李 欣， 哈小琴*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學 臨床醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730030；2.人民解放軍聯(lián)勤保障部隊 第九四〇醫(yī)院檢驗科，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，甘肅 蘭州 730050)

自1990年開始，細菌治療的臨床前研究取得了很大的進展[1]。減毒沙門氏菌作為目前FDA批準的可用于疫苗生產(chǎn)的工程菌，是腫瘤靶向領(lǐng)域中研究最廣泛的細菌。研究表明，與正常靶器官相比，減毒沙門氏菌在腫瘤組織中優(yōu)先定殖，腫瘤組織與正常組織比例大于1 000∶1[2]。此外，減毒沙門氏菌其本身所含的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid, LTA)和鞭毛蛋白等可引起機體產(chǎn)生免疫反應，誘導T淋巴細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞等數(shù)量增加，增強宿主的免疫應答能力[3-4]，同時，減毒沙門氏菌作為基因治療載體可通過口服方式給藥，屬于非侵襲性給藥，其給藥方式安全，易施行?；谝陨咸匦裕瑴p毒沙門氏菌作為基因治療載體，具有良好的應用價值。1997年，Date等[5]對重組人肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)消化裂解發(fā)現(xiàn)了一種新的全面拮抗HGF生物活性的拮抗劑——NK4。NK4是HGF的變體形式，可與HGF競爭性結(jié)合c-Met受體，從而阻遏HGF/c-Met 系統(tǒng)的信號傳導[6]。研究表明，NK4可抑制人肝癌MHCC-97H細胞的增殖和遷移以及腫瘤血管生成具有抑制作用[7]，有良好的抗腫瘤效果。而白細胞介素-2(IL-2)是由活化的T細胞產(chǎn)生的細胞因子，可增加細胞毒性T細胞、NK細胞和單核細胞的增殖和活化[8]。重組IL-2在臨床中的抗腫瘤活性使其分別于1992年和1998年獲得FDA的批準，應用于轉(zhuǎn)移性腎癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的治療，總緩解率在黑色素瘤中為16%，在RCC中為15%[9-10]。多年來，IL-2被廣泛應用于治療癌癥[11]。本研究將NK4 和IL-2基因連接到PIRES-SEQ質(zhì)粒上，形成pCMV-IL-2-IRES-NK4，隨后將其電轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌Ty21a中，形成最終攜帶NK4和IL-2基因的減毒沙門氏菌，命名為TPIN，因PIRES-SEQ質(zhì)粒上含有氨芐青霉素(Amp)基因位點，所以TPIN可在含有Amp LB平板上生長，以此篩選陽性菌落，即TPIN。前期實驗研究表明TPIN經(jīng)口服后可抑制瘤體生長以及增強自身免疫反應[12]。為了進一步進行TPIN的批量生產(chǎn)，本研究以探究TPIN的穩(wěn)定性為目的，從目的基因片段的大小和目的蛋白的表達兩方面觀察TPIN的遺傳穩(wěn)定性，確保質(zhì)粒在傳代過程中無丟失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源和細胞 鼠傷寒減毒沙門氏菌Ty21a購自中國藥品生物制品檢定所，TPIN為本實驗室制備，人肝癌細胞HepG2購自中國科學院上海細胞所。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨 1%，酵母提取物 0.5%，NaCl 1%，121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基另外加入瓊脂糖 1.5%。②LA培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素(培養(yǎng)基冷卻至60 ℃左右時加入)，終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

1.1.3 試劑與儀器 PremixTaqTM、XhoⅠ、MluⅠ、SalⅠ、NotⅠ限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司)；瓊脂糖、TAE電泳緩沖液(索萊寶公司)；SuperRed/GelRed 核酸染色液(白鯊生物科技)；氨芐西林鈉(石家莊華北制藥集團)；人肝細胞生長因子(HGF)ELISA、人白細胞介素-2 ELISA試劑盒(上海江萊生物有限公司)；革蘭染色液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；杜氏磷酸鹽緩沖液(D-PBS)(gibco公司)。高速低溫離心機(5417R，德國Eppendorf公司)；酶標儀(M200 PRO，瑞士Tecan集團)；電子分析天平(AUW120D，日本Shimadzu公司)；PCR儀(System 9700，美國ABI公司)；凝膠成像系統(tǒng)(UVItee，美國ABI公司)；穩(wěn)壓電泳系統(tǒng)(PowerSupply，北京六一公司)；電熱恒溫水浴箱(HH.W21.420，北京科偉永興儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 傳代方法 將保存的初代菌用四區(qū)劃線法接種于LA和LB平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱24 h，分別取生長良好的單克隆菌落于10 mL LA和LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6時，取100 μL于LA和LB平板培養(yǎng)，完成傳代1次，按此方式連續(xù)傳代40次，取10代、20代、30代、40代菌落進行穩(wěn)定性檢測。

1.2.2 涂片檢查 TPIN每10代進行涂片檢查。取1滴生理鹽水于蓋玻片上，用接種環(huán)挑取待測菌落制作涂片，置于酒精燈上方快速過3次固定后進行革蘭染色。

1.2.3 菌落PCR TPIN每5代進行菌落PCR觀察目的基因有無丟失。用接種針挑取待測菌落于0.2 mL PCR管中，加入10 μL無菌水中混勻，蓋緊。100 ℃煮沸5 min，-20 ℃冷凍5 min，重復2次后，5 000 r/min離心5 min，取上清作DNA模板，進行菌落PCR擴增目的基因和啟動子CMV?；靹颍x心，去氣泡，上機檢測。PCR儀擴增溫度設置：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min/kb，共30個循環(huán)，取擴增產(chǎn)物進行電泳檢測(表1、表2)。

表1 引物序列表

表2 PCR反應體系

1.2.4 雙酶切鑒定 挑取待測菌落于10 mL LA和LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)10 h后，按質(zhì)粒提取試劑盒操作提取質(zhì)粒，測濃度后進行雙酶切鑒定(表3)。

表3 酶切體系

取上述混合物于37 ℃水浴1 h后，取酶切產(chǎn)物進行電泳分析。

1.2.5 TPIN轉(zhuǎn)染HepG2細胞 挑取新鮮接種的TPIN和Ty21a初始代菌落分別接種于10 mL LA和10 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)OD600為0.6，離心，D-PBS洗滌3遍后，調(diào)整細菌濃度為1×108cfu/mL用于細胞轉(zhuǎn)染。將1×106個HepG2細胞接種于25 cm2細胞瓶中，待細胞貼壁后，分為3組：TPIN組、Ty21a組和PBS組，以1×108cfu加入細胞中共孵育2 h，棄去菌懸液，D-PBS洗滌3次后加入含慶大霉素10 ng/mL DMED培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h后，D-PBS洗滌3次，加入含雙抗的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于12、24、48、72 h檢測3組NK4和IL-2蛋白表達情況。按上述轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染初始代、10代、20代、30代和40代TPIN，同時設Ty21a組和PBS組作對照，觀察48 h NK4蛋白表達和72 h IL-2蛋白表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落和菌體形態(tài)分析

菌落和菌體形態(tài)如圖1、圖2所示，TPIN 10代、20代、30代和40代在LA和LB平板上菌落形態(tài)一致，均為淡黃色半透明、邊緣整齊、表面光滑濕潤的圓形菌落。

2.2 菌落PCR

各代TPIN菌落PCR結(jié)果顯示，在LA和LB平板上均可擴增出NK4、IL-2和CMV基因且片段大小合適，分別為1.4 kb、444 bp和140 bp，表明TPIN在傳代過程中質(zhì)粒無丟失(圖3、圖4)。此外，在沒有抗生素的選擇壓力下TPIN也可擴增出相應目的基因，進一步表明本實驗室構(gòu)建的TPIN在沒有Amp的條件下也可穩(wěn)定傳代，表達相應目的基因。

圖1 各代TPIN在LA平板上的菌落和菌體特征Fig.1 Colony and bacterial characteristics of each generation of TPIN in LA platesA～D：TPIN 10代、20代、30代和40代在LA平板上的菌落形態(tài)；E～H：油鏡下TPIN 10代、20代、30代和40代在LA平板上革蘭染色菌體形態(tài)A-D: Colony morphology of TPIN 10 th, 20 th, 30 th and 40 th generation on LA plates; E-H: Morphology of Gram-stained cells on LA plates of TPIN 10 th, 20 th, 30 th and 40 th generations under oil lens of OLYMPUS microscope

圖2 各代TPIN在LB平板上的菌落和菌體特征Fig.2 Colony and bacterial characteristics of each generation of TPIN in LB platesa～d：TPIN 10代、20代、30代和40代在 LB平板上的菌落形態(tài)；e～h：油鏡下TPIN 10代、20代、30代和40代在 LB平板上革蘭染色菌體形態(tài)a-d: Colony morphology of TPIN 10 th, 20 th, 30 th and 40 th generation on LB plates; e-h:Morphology of Gram-stained cells on LB plates of TPIN 10 th, 20 th, 30 th and 40 th generations under oil lens of OLYMPUS microscope

2.3 雙酶切鑒定

TPIN在LA和LB平板上培養(yǎng)第10代、20代、30代和40代后，提取質(zhì)粒并測其濃度，結(jié)果顯示在含Amp和不含Amp的傳代過程中，質(zhì)粒濃度穩(wěn)定(表4)，無明顯降低。雙酶切結(jié)果顯示，LA和LB平板上培養(yǎng)第10代、20代、30代和40代TPIN中所含質(zhì)粒均可被相應的限制性內(nèi)切酶切割出目的基因條帶，由于XhoI在TPIN質(zhì)粒中存在兩個酶切位點，一個位于質(zhì)粒IRES序列上，一個位于NK4基因上，因此XhoI單酶切有兩個片段，經(jīng)查詢，兩個片段大小分別為1.6 kb和4.5 kb，與電泳結(jié)果相符。因此，MluI和XhoI雙酶切可存在3個片段，其大小分別為444 bp(IL-2)、1.1 kb和4.5 kb，與電泳結(jié)果相符(圖5、圖6)。 雙酶切結(jié)果顯示即使在無抗生素選擇的壓力下，TPIN所含質(zhì)粒也可被限制性內(nèi)切酶有效切割目的基因片段。

表4 質(zhì)粒濃度與純度

2.4 NK4和IL-2蛋白表達

初代TPIN轉(zhuǎn)染HepG2細胞結(jié)果如圖7A所示，與PBS組和Ty21a組相比，TPIN組NK4蛋白表達顯著升高(P<0.01)，并于48 h達到高峰，質(zhì)量濃度為(1.953±0.082)ng/mL；如圖7B所示，與PBS組和Ty21a組相比，TPIN組IL-2蛋白表達顯著升高(P<0.01)并于72 h達到高峰，其質(zhì)量濃度為(2.080±0.139) ng/mL。

圖3 各代TPIN菌落PCR結(jié)果Fig.3 PCR results of each generation of TPIN colonies1、10、19：DL2000 DNA Marker；2～9：TPIN在LA平板上第5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40代NK4擴增產(chǎn)物；11～18：TPIN在LA平板上5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40代IL-2擴增產(chǎn)物；20～27：TPIN在LA平板上5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40代CMV擴增產(chǎn)物1, 10, 19: DL2000 DNA Marker; 2-9: 5 th, 10 th, 15 th, 20 th, 25 th, 30 th, 35 th, and 40 th generation NK4 amplification products of TPIN on LA plate; 11-18: 5 th, 10 th, 15 th, 20 th, 25 th, 30 th, 35 th, and 40 th generation IL-2 amplification products of TPIN on LA plate; 20-27: 5 th, 10 th, 15 th, 20 th, 25 th, 30 th, 35 th, and 40 th generation CMV amplification products of TPIN on LA plate

圖4 各代TPIN菌落PCR結(jié)果Fig.4 PCR results of each generation of TPIN colonies1、10、19：DL2000 DNA Marker；2～9：TPIN在LB平板上第5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40代NK4擴增產(chǎn)物；11～18：TPIN在LB平板上5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40代IL-2擴增產(chǎn)物；20～27：TPIN在LB平板上5代、10代、15代、20代、25代、30代、35代、40代CMV擴增產(chǎn)物1, 10, 19: DL2000 DNA Marker; 2-9: 5 th, 10 th, 15 th, 20 th, 25 th, 30 th, 35 th, and 40 th generation NK4 amplification products of TPIN on LB plate; 11-18: 5 th, 10 th, 15 th, 20 th, 25 th, 30 th, 35 th, and 40 th generation IL-2 amplification products of TPIN on LB plate; 20-27: 5 th, 10 th, 15 th, 20 th, 25 th, 30 th, 35 th, and 40 th generation CMV amplification products of TPIN on LB plate

圖5 LA平板TPIN雙酶切結(jié)果Fig.5 Double digestion results of TPIN on LA plate 1、18：DL2 000 DNA Marker；2、6、10、14：10代、20代、30代、40代質(zhì)粒Mlu I單酶切；3、7、11、15：10代、20代、30代、40代質(zhì)粒Xho I單酶切；4、8、12、16：10代、20代、30代、40代質(zhì)粒Not I、Sal I雙酶切；5、9、13、17：10代、20代、30代、40代質(zhì)粒Mlu I、Xho I雙酶切1, 18: DL2 000 DNA Marker; 2, 6, 10, 14: Mlu I single digestion of 10 th, 20 th, 30 th, 40 th generation plasmid; 3, 7, 11, 15: Xho I single digestion of 10 th, 20 th, 30 th, 40 th generation plasmid; 4, 8, 12, 16: Not I, Sal I double digestionof 10 th, 20 th, 30 th, 40 th generation plasmid; 5, 9, 13, 17: Mlu I, Xho I double digestion of 10 th, 20 th, 30 th, 40 th generation plasmid

圖6 LB平板TPIN雙酶切結(jié)果Fig.6 Double digestion results of TPIN on LB plate 1、18：DL2 000 DNA Marker；2、6、10、14：10代、20代、30代、40代質(zhì)粒Mlu I單酶切；3、7、11、15：10代、20代、30代、40代質(zhì)粒Xho I單酶切；4、8、12、16：10代、20代、30代、40代質(zhì)粒Not I、Sal I雙酶切；5、9、13、17：10代、20代、30代、40代質(zhì)粒Mlu I、Xho I雙酶切 1, 18: DL2 000 DNA Marker; 2, 6, 10, 14: Mlu I single digestion of 10 th, 20 th, 30 th, 40 th generation plasmid; 3, 7, 11, 15: Xho I single digestion of 10 th, 20 th, 30 th, 40 th generation plasmid; 4, 8, 12, 16: Not I, Sal I double digestionof 10 th, 20 th, 30 th, 40 th generation plasmid; 5, 9, 13, 17: Mlu I, Xho I double digestion of 10 th, 20 th, 30 th, 40 th generation plasmid

圖7 NK4和IL-2蛋白表達水平Fig.7 Expression level of NK4 and IL-2 proteinsA：NK4蛋白表達； B：IL-2蛋白表達；*：與PBS組相比P<0.05，**：與PBS組相比P<0.01；#：與Ty21a組相比P<0.05，##：與Ty21a組相比P<0.01；PBS：對照組，Ty21a：空載體組，TPIN：TPIN實驗組，下圖同A: The expression of NK4 protein; B: The expression of IL-2 protein; *: Compared with PBS group, P<0.05; **: Compared with PBS group, P<0.01; #: Compared with Ty21a group, P<0.05; ##: Compared with Ty21a group, P<0.01， the same as below

將1代、10代、20代、30代和40代TPIN轉(zhuǎn)染HepG2細胞后， 其轉(zhuǎn)染結(jié)果顯示，與PBS組相比，NK4蛋白表達在48 h明顯增加(P<0.01)且每代間NK4蛋白表達無差異(P>0.05)。同樣，與PBS組相比，IL-2蛋白表達在96 h明顯增加(P<0.01)且每代間IL-2蛋白表達無差異(P>0.05)，見圖8。

圖8 每10代間NK4和IL-2蛋白表達水平Fig.8 Expression levels of NK4 and IL-2 proteins per 10 generations

3 討 論

基因工程菌(Gene Engineering Bacteria)是利用基因工程技術(shù)，將外源目的基因?qū)胨拗骷毎蛊浔磉_所需蛋白的重組菌[13]。基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性對生物制藥至關(guān)重要，其穩(wěn)定性是進行擴大生產(chǎn)的前提。目前，在美國有兩種獲得許可的傷寒疫苗可用于人類，其中包括Ty21a[14-15]。Ty21a由于進行幾種減毒突變，其在細胞中存活能力差，只有在最初的24 h 內(nèi)檢測到非常低的脫落。這導致疫苗株具有極好地安全性，在過去30年中，全球范圍內(nèi)已有超過2億種疫苗的接種[16]。因此，本課題組選用Ty21a作為遞送基因的載體，利用基因重組技術(shù)將NK4和IL-2基因?qū)隩y21a中用于治療消化道腫瘤。

本研究構(gòu)建的攜帶NK4/IL-2基因的減毒沙門氏菌TPIN具有較高的穩(wěn)定性。本研究主要從傳代方面觀察TPIN在遺傳穩(wěn)定性方面的改變，將TPIN在含和不含Amp的LB平板上連續(xù)傳代40次后，觀察NK4和IL-2基因和蛋白的表達情況。研究結(jié)果顯示，每10代間菌體和菌落的形態(tài)一致，均符合沙門氏菌的形態(tài)特征，表明傳代次數(shù)和攜帶的目的基因?qū)p毒沙門氏菌的生長不產(chǎn)生影響。傳代后TPIN每5代可擴增出攜帶的目的基因片段(NK4(1 460 bp)和IL-2(444 bp))和啟動子CMV(140 bp)；每10代可雙酶切出NK4和IL-2片段，表明在傳代過程中，NK4和IL-2基因不隨傳代次數(shù)的增加而丟失。此外，將TPIN轉(zhuǎn)染HepG2細胞結(jié)果顯示，NK4和IL-2蛋白具有明顯升高的趨勢，分別于48 h和72 h達到高峰，而每10代TPIN轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，其每10代間表達并無差異，表明TPIN可有效感染HepG2細胞且傳代次數(shù)并不影響NK4和IL-2蛋白的表達。

本研究通過對TPIN連續(xù)傳代，從菌落和菌體特征、目的基因存在和表達方面觀察后發(fā)現(xiàn)，其連續(xù)傳代40次后，TPIN仍具有良好的穩(wěn)定性，可穩(wěn)定表達相應的目的基因和蛋白。研究結(jié)果表明，TPIN的遺傳穩(wěn)定性良好，可進一步用于擴大生產(chǎn)和生物制藥。