張凱，趙龍

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 牡丹江 157000

在糖尿病患者中糖尿病腎病是較為常見的微血管并發(fā)癥，系膜增生與基底膜增厚是其主要的病理結(jié)構(gòu)特征，最終能夠?qū)е履I小球硬化以及腎間質(zhì)纖維化情況出現(xiàn)，嚴(yán)重威脅患者身體健康及生命安全[1]。P38是絲裂原活化蛋白激酶(簡(jiǎn)稱MAPK)家族的重要成員之一，并在糖尿病腎病發(fā)生以及發(fā)展中具有至關(guān)重要的作用，同時(shí)在細(xì)胞外基質(zhì)纖維化等諸多生理及病理過程中均有參與[2]。相關(guān)研究顯示，機(jī)體內(nèi)的高糖情況還能夠誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(簡(jiǎn)稱PPAR-γ)出現(xiàn)表達(dá)降低情況，從而導(dǎo)致胞外基質(zhì)由于降解減少而出現(xiàn)堆積情況，系膜增生后能夠?qū)е履I小球硬化情況出現(xiàn)，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生[3-4]。據(jù)臨床實(shí)踐顯示，車前草具有較好的祛痰、利尿以及明目等效果，許多國(guó)家將其作為保健食品的原料以及傳統(tǒng)藥草進(jìn)行應(yīng)用[5]。本研究通過對(duì)糖尿病腎纖維化大鼠采用車前草水提取物治療，從而探討對(duì)p38 MAPK/過氧PPAR-γ通路的影響。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取2018年1月—2018年12月在某醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)的60只大鼠[動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(廣)2008—2009]作為本研究對(duì)象。大鼠體重為160～180g，平均(170.4±11.8)g，均對(duì)所有大鼠進(jìn)行1周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，濕度40%～60%，溫度(23.2±1.8)℃，動(dòng)物造模前自由進(jìn)水，但禁食12h，該研究符合相關(guān)的動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥物 將100g車前草采用純水浸泡20min，之后采用100mL水進(jìn)行2次煎煮，待煮沸后采用文火煮30min，合并2次藥液后經(jīng)蒸發(fā)濃縮至100mL，其中含1g/mL的生藥量，最后冷藏備用。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型 將50只大鼠采用高脂高糖喂養(yǎng)與65mg/kg的鏈脲佐菌素經(jīng)單次腹腔注射的方式建立糖尿病腎病大鼠模型。并將剩余的10只大鼠作為對(duì)照組，并給予其等量的檸檬酸鹽溶液注射。在鏈脲佐菌素注射后的第3天與第7天分別采集大鼠的尾靜脈血進(jìn)行血糖值檢測(cè)，若連續(xù)兩次的血糖值均 ≥16.5mmoL/L則為模型制備成功。

1.2.2 分組與給藥 在造模成功1周之后，取造模成功的40只大鼠隨機(jī)分為車前草低劑量組、高劑量組，陽性藥物組與模型組，各10只。其中，車前草低劑量組與高劑量組的給藥分別為1.15g/kg、4.64g/kg；陽性藥物組，纈沙坦(生產(chǎn)廠家：北京諾華制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20173014)4.8×10-3g/kg，每天經(jīng)灌胃給藥1次，給藥體積約為1mL/次。此外，對(duì)照組與模型組均按照體重給予等體積的生理鹽水灌注，連續(xù)灌注及給藥12周。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)生化指標(biāo)檢測(cè)。在用藥12周后，分別對(duì)大鼠的空腹血肌酐(serum creatinine,Scr)與血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平進(jìn)行測(cè)量，并將大鼠置入代謝籠內(nèi)，收集其24h的尿液，取其上清液對(duì)其24h尿蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。

(2)在治療12周后對(duì)各組大鼠進(jìn)行血清中腎纖維化相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，采用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)主要包含大鼠半胱氨酸蛋白酶抑制劑/胱抑素C(CysC)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑抑制因子 1(tissue inhibitors of metalloproteinase 1,TIMP-1)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor 1,TGF-β1)。(3)檢測(cè)并比較各組大鼠腎組織的相關(guān)指標(biāo)，主要包含P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ的表達(dá)水平，具體為：①HE染色，在給藥12周之后將大鼠采用頸椎脫臼方法處死，經(jīng)腹腔將其左腎取出，并沿腎臟矢狀面將其一分為二。之后將其中一半腎臟放入濃度為10%的中性甲醛中進(jìn)行固定，并做常規(guī)的脫水處理，在進(jìn)行石蠟包埋后用作HE染色；同時(shí)將另一半放入液氮中進(jìn)行凍存。將大鼠的腎組織標(biāo)本切為5μm厚度，為避免出現(xiàn)脫片情況，對(duì)其進(jìn)行2h的60℃烤片，在HE染色后置于光鏡下進(jìn)行仔細(xì)觀察，并進(jìn)行相應(yīng)的組織病理學(xué)檢測(cè)。②Western blot分析，將在液氮中保存的腎組織取出，并經(jīng)充分研磨后將適量的蛋白緩沖液加入其中，依據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行蛋白提取，并利用BCA法定量進(jìn)行相應(yīng)的濃度調(diào)節(jié)。之后去50μg的蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，將其浸入濃度為5%的脫脂奶粉中并進(jìn)行1h的避光封存；經(jīng)洗滌后浸入一抗稀釋液當(dāng)中，其中P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ的具體稀釋比例為1:1000，之后放入4℃的環(huán)境中孵育過夜，次日清晨進(jìn)行第二次洗滌，之后浸入二抗稀釋液當(dāng)中，比例為1:5000，再經(jīng)1h的室溫?fù)u床孵育，洗滌采用ECL發(fā)光液進(jìn)行滴加，經(jīng)3次曝光，選取相應(yīng)的重疊值，其中采用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度值分析，采用β-actin進(jìn)行內(nèi)參蛋白分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS21.0進(jìn)行分析，其中計(jì)數(shù)資料以(例/%)表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以()表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Scr、BUN及24h尿蛋白含量對(duì)比模型組的Scr、BUN及24h尿蛋白含量均高于對(duì)照組、陽性藥物組及低劑量、高劑量組，且高劑量用藥物組的Scr、BUN及24h尿蛋白含量均低于低劑量用藥組(P＜0.05)，具體見表1。

表1 比較各組大鼠的Scr、BUN及24h尿蛋白含量()

表1 比較各組大鼠的Scr、BUN及24h尿蛋白含量()

2.2 大鼠血清纖維化的相關(guān)指標(biāo)各組大鼠的CysC、TIMP-1及TGF-β1指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且高劑量用藥組的各項(xiàng)指標(biāo)均低于低劑量組(P＜0.05)，具體見表2。

表2 比較各組大鼠血清腎纖維化的相關(guān)指標(biāo)()

表2 比較各組大鼠血清腎纖維化的相關(guān)指標(biāo)()

2.3 大鼠腎組織P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ表達(dá)水平對(duì)比各組大鼠的P-P38 MAPK及PPAR-γ水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且高劑量用藥組的P-P38 MAPK水平低于低劑量組，而PPAR-γ水平高于低劑量組(P＜0.05)，各組的P38 MAPK水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具體見表3。

表3 比較各組大鼠腎組織P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ表達(dá)水平()

表3 比較各組大鼠腎組織P38 MAPK、P-P38 MAPK及PPAR-γ表達(dá)水平()

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病患者中較為嚴(yán)重的并發(fā)癥類型，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿情況時(shí)，若不采取及時(shí)有效的救治措施，則極有可能導(dǎo)致腎衰竭，從而對(duì)患者身體健康及生命安全造成嚴(yán)重威脅[6]。因此，積極尋求科學(xué)、有效的治療藥物對(duì)逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病具有至關(guān)重要的作用。

本研究中通過采用脲佐菌素誘導(dǎo)而建立相應(yīng)的糖尿病腎病大鼠模型，并經(jīng)HE染色顯示，模型組的大鼠腎臟出現(xiàn)顯著萎縮情況，腎小管顯著擴(kuò)張，系膜基質(zhì)明顯增加，腎小球存在硬化情況[7]。而經(jīng)車前草水提取物治療后期腎臟病變情況顯著緩解，且給藥濃度較高的大鼠其腎臟病變的嚴(yán)重情況相對(duì)較輕，從而說明在對(duì)糖尿病腎病大鼠在進(jìn)行腎組織損傷修復(fù)的過程中，采用車前草水提取物治療具有較好效果[8-9]。經(jīng)本研究顯示，模型組的Scr、BUN及24h尿蛋白含量均高于對(duì)照組、陽性藥物組及低劑量、高劑量組，且高劑量用藥物組的Scr、BUN及24h尿蛋白含量均低于低劑量用藥組(P＜0.05)。由此可見，采用高劑量的車前草水提取物治療能夠促使糖尿病腎病大鼠的腎功能指標(biāo)得到顯著改善，并對(duì)大鼠腎功能損傷情況進(jìn)行有效保護(hù)。糖尿病腎病患者在出現(xiàn)腎功能損傷的同時(shí)，也會(huì)伴有不同程度的腎臟纖維化情況，其主要特征為胞外基質(zhì)的異常堆積[10]。血管活性物質(zhì)、高血糖以及炎性因子等多種纖維化細(xì)胞因子存在的異常高表達(dá)情況及其相互之間的作用，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化[11]。

糖蛋白以及膠原蛋白合成代謝情況的明顯增加，從而極易導(dǎo)致CysC、TIMP-1及TGF-β1等與腎纖維化密切相關(guān)的指標(biāo)出現(xiàn)異常升高情況[12]。其中，TIMP-1還與腎纖維化中的血管重塑緊密相關(guān)，而TGF-β1則是至關(guān)重要的致纖維化因子，在機(jī)體胞外基質(zhì)平衡的維持中具有重要作用，同時(shí)還能夠有效調(diào)控機(jī)體的炎性反應(yīng)，致使胞外基質(zhì)合成及堆積情況增加，胞外基質(zhì)降解的情況也得到有效抑制。綜合上述指標(biāo)，它們都能對(duì)腎纖維化程度進(jìn)行有效反應(yīng)[13]。在本研究中發(fā)現(xiàn)：各組大鼠的CysC、TIMP-1及TGF-β1指標(biāo)均存在顯著差異(P＜0.05)，且高劑量用藥組的各項(xiàng)指標(biāo)均低于低劑量組(P＜0.05)。由此說明，對(duì)糖尿病腎病大鼠采用車前草水提取物治療，能夠促使CysC、TIMP-1及TGF-β1表達(dá)情況得到有效抑制，進(jìn)而減緩腎纖維化進(jìn)程。

P38 MAPK是MAPK中的重要家族成員，是進(jìn)行細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，幾乎在生物體的整個(gè)生理及病理過程中均有參與，尤其是氧化應(yīng)激以及炎性反應(yīng)等[14]。P38 MAPK主要在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，在機(jī)體正常的生理狀況下其活性相對(duì)較低，經(jīng)磷酸化激活后P-P38 MAPK轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，能夠磷酸化激活較多的轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)炎性因子等所累靶基因表達(dá)情況進(jìn)行有效調(diào)控，同時(shí)與機(jī)體糖尿病血管并發(fā)癥的出現(xiàn)緊密相關(guān)[15]。在細(xì)胞因子表達(dá)機(jī)制的有效調(diào)控中P38 MAPK具有至關(guān)重要的作用，通過對(duì)該通路進(jìn)行有效抑制能夠?qū)Υ傺滓蜃拥谋磉_(dá)情況進(jìn)行有效抑制，機(jī)體炎癥反應(yīng)情況得到有效緩解[16]。在本研究中經(jīng)Western blot分析顯示：各組大鼠的P-P38 MAPK及PPAR-γ水平均存在顯著差異(P＜0.05)，且高劑量用藥組的P-P38 MAPK水平低于低劑量組，而PPAR-γ水平高于低劑量組(P＜0.05)，說明采用車前草水提取物能夠有效降低大鼠的P-P38 MAPK水平，而PPAR-γ水平得到有效提升。經(jīng)車前草水提取物及陽性藥物干預(yù)后，與模型組比較大鼠的P-P38 MAPK水平明顯降低，且高劑量給藥組的水平相對(duì)較低，由此可見，經(jīng)車前草水提取物干預(yù)后能夠有效抑制P38 MAPK的磷酸化過程[17]。

PPAR-γ屬于核因子超家族中的一員，能夠?qū)Υ罅炕虮磉_(dá)所需的核受體進(jìn)行有效調(diào)節(jié)，并在機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)及糖脂代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，高糖能夠促使腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)的PPAR-γ水平得到顯著提升，從而導(dǎo)致胞外基質(zhì)沉積以及系膜增生情況出現(xiàn)，最終導(dǎo)致腎小球硬化以及纖維化[18-19]。對(duì)于糖尿病腎病中腎組織損傷的大鼠采用車前草水提取物能夠促使PPAR-γ表達(dá)情況得到有效激活，P38 MAPK通路得到有效抑制，腎纖維化情況得到有效緩解[20]。但由于糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，對(duì)糖尿病腎病采用車前草水提取物治療的過程中，對(duì)于其具體的作用機(jī)理還需更多的臨床研究及實(shí)踐來證實(shí)。

綜上所述，對(duì)糖尿病腎病大鼠采用車前草水提取物治療，能夠顯著降低對(duì)大鼠腎臟的損傷，腎纖維化情況顯著減輕，該情況出現(xiàn)的原因可能與P38 MAPK通路受到顯著抑制以及PPAR-γ通路得到有效激活的情況有關(guān)。