楊春偉，孫海燕，崔大偉，丁偉(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院a.病理科，b.輸血科，杭州310003；.紹興第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江紹興31000)

新型冠狀病毒又稱為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，導(dǎo)致人類嚴(yán)重呼吸綜合征(稱為COVID-19)[1-3]。根據(jù)WHO疫情通報(bào)顯示：截止2020年3月31日，我國累計(jì)確認(rèn)82 554病例，死亡3 314例，全球205個(gè)國家發(fā)生確認(rèn)病例，累計(jì)確認(rèn)750 890例，死亡57 610例(https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/situation-reports/

20200331-sitrep-71-covid-19.pdf?sfvrsn=4360e92b_8)。SARS-CoV-2與SARS-CoV的基因組同源性約為80%，與蝙蝠冠狀病毒(SARS-CoV-RaTG13)的同源性約為96%[4-6]。冠狀病毒表面的刺突糖蛋白(spike glycoprotein, S)通過其受體結(jié)構(gòu)域(RBD)識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)，在介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合導(dǎo)致細(xì)胞感染的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這使S蛋白成為中和抗體和疫苗的主要抗原靶點(diǎn)[6-8]。S蛋白的變異嚴(yán)重影響SARS-CoV-2對宿主的感染，因此探討S蛋白的變異情況將有助于SARS-CoV-2流行的控制。

1 資料與方法

1.1資料 從全球共享禽流感數(shù)據(jù)庫(GISAID)和GenBank數(shù)據(jù)庫收集2019年12月至2020年3月27日中國大陸255株SARS-CoV-2的S蛋白基因序列，同時(shí)下載SARS-CoV、MERS、蝙蝠冠狀病毒和穿山甲感染的冠狀病毒序列共12個(gè)，作為參考株：Human SARS coronavirus BJ01-2003(AY278488.2)、Human SARS coronavirus GZ02-2003(AY390556.1)、MERS coronavirus(NC-019843.3)-2012、bat-SL-CoVZC45-2018(MG772933.1)、bat-SL-CoVZXC21-2018(MG772934.1)、bat-coronavirus-RaTG13-2020(MN996532.1)、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P5L/2017/EPI-ISL-410540、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P5E/2017/EPI-ISL-410541、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P4L/2017/EPI-ISL-410538、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P2V/2017/EPI-ISL-410542、hCoV-19/pangolin/Guangxi/P1E/2017/EPI-ISL-410539、hCoV-19/pangolin/Guangdong/1/2019/EPI-ISL-410721。

1.2方法 利用MEGA 6.0分子進(jìn)化遺傳分析軟件，用鄰接法(Neighbour-Jioning, N-J)對下載的冠狀病毒S氨基酸序列構(gòu)建氨基酸種系分子進(jìn)化樹，自展值(Bootstrap)設(shè)置為1 000，同時(shí)對S氨基酸序列的分子變異特征進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1S糖蛋白同源性和種系進(jìn)化分析 中國大陸SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示：從GISAID和GenBank數(shù)據(jù)庫收集的255株SARS-CoV-2的S蛋白氨基酸序列相互間差異較小，處于同一分支，其同源性為96.8%～100%。其中，hCoV-19/Shanghai/SH0104/2020/EPI-ISL-416395與其余254株SARS-CoV-2的S蛋白序列的氨基酸同源性僅為89.9%～93.7%；12株參考株S蛋白氨基酸序列的差異較大，同源性為34.1%～99.9%，其中MERS coronavirus(NC-019843.3)與其他11株的同源性最差，為34.1%～39.1%；12株參考株中，bat-coronavirus-RaTG13(MN996532.1)的S蛋白序列與255株SARS-CoV-2的氨基酸同源性最近，為86.6%～93.4%，而bat-SL-CoVZC45(MG772933.1)和bat-SL-CoVZXC21(MG772934.1)與255株SARS-CoV-2的S蛋白同源性分別為70.3%～75.6%和69.6%～75.1%；MERS coronavirus(NC-019843.3)與255株SARS-CoV-2的氨基酸同源性最遠(yuǎn)(34.9%～39.1%)；2株Human SARS coronavirus BJ01和Human SARS coronavirus GZ02，與255株SARS-CoV-2的S蛋白同源性均為66.2%～71.8%；6株穿山甲感染的冠狀病毒與255株SARS-CoV-2的S蛋白同源性為76.9%～84.8%。見圖1。

2.2S糖蛋白氨基酸位點(diǎn)變異分析 255株SARS-CoV-2病毒S蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)L455、F486、Q493、S494、N501和Y505均未發(fā)生變異，且S蛋白RBD受體結(jié)合域關(guān)鍵位點(diǎn)N439，V483和Q493也均未發(fā)生變異；255株SARS-CoV-2病毒S蛋白的變異情況如下：5株發(fā)生H49Y突變，3株為D614G突變，2株為M153T突變，2株為V1040F突變，2株為I1216T突變，Y28D/N突變各1株等。此外，在255株病毒的RBD(306～543aa)域中，僅有hCoV-19/Shenzhen/SZTH-004/2020/EPIISL406595發(fā)生N354D和D364Y突變，hCoV-19/Shanghai/SH0017/2020/EPIISL416328發(fā)生S359N突變，hCoV-19/Shanghai/SH0007/2020/EPIISL416320發(fā)生K378R突變， hCoV-19/Guangdong/GD2020087-P0008/2020/EPIISL413863發(fā)生Q409E突變。見表1。

表1SARS-CoV-2病毒S蛋白氨基酸變異分析

3 討論

冠狀病毒科(CoV)是已知的最大的單股正鏈RNA病毒，根據(jù)血清學(xué)與基因組的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，冠狀病毒通常被分為α、β、γ和δ 4個(gè)屬，SARS、SARS-CoV-2和MERS均屬于β-CoV屬[4-5]。目前，對于SARS-CoV-2感染人群的治療，除了有效隔離和常規(guī)的對癥治療以外，特效藥物和疫苗的研發(fā)仍在進(jìn)行中。SARS-CoV-2的基因特征特別是S蛋白的分子特征對于藥物和疫苗的研發(fā)至關(guān)重要[6-7]。本研究從GISAID和GenBank數(shù)據(jù)庫下載255條SARS-CoV-2的S蛋白序列，其由1 273個(gè)氨基酸組成。通過系統(tǒng)發(fā)育樹顯示發(fā)現(xiàn)，255株SARS-CoV-2的S蛋白處于同一分支，且同源性為96.8%～100%，表明中國大陸SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列高度同源，相互間變異較小，與近期的研究結(jié)果相似[9-11]。初步表明在我國流行的SARS-CoV-2 S蛋白序列并未發(fā)生明顯變異。進(jìn)一步分析顯示，255株SARS-CoV-2的S蛋白序列與參考株之間存在一定差異，與bat-coronavirus-RaTG13 (MN996532.1)的S蛋白序列的氨基酸同源性最近且高達(dá)93.4%，與近期的研究結(jié)果相一致[10-13]。

研究表明，SARS-CoV-2通過S蛋白受體結(jié)構(gòu)域RBD與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合，介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合，促進(jìn)病毒的侵入，而RBD域是SARS及其相關(guān)冠狀病毒基因組種最容易變異的區(qū)域，特別是關(guān)鍵氨基酸對與人體ACE2受體結(jié)合及確定宿主類型至關(guān)重要[6-8]。本研究顯示，S蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)L455、F486、Q493、S494、N501和Y505均未發(fā)生變異，且S蛋白RBD受體結(jié)合域中的關(guān)鍵位點(diǎn)N439、V483和Q493也均未發(fā)生變異，提示SARS-CoV-2容易通過RBD域與人體ACE2結(jié)合，導(dǎo)致病毒的感染與流行，這與之前報(bào)道的結(jié)果相一致[10-11]。此外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)，S蛋白中某些位點(diǎn)氨基酸發(fā)生變異，如5株發(fā)生H49Y突變，3株為D614G突變等，重要的是部分SARS-CoV-2的S蛋白區(qū)RBD域發(fā)生變異(如N354D、D364Y、S359N、K378R和Q409E)，但這些變異是否影響S蛋白及RBD域的結(jié)構(gòu)和功能仍需進(jìn)一步深入研究。

總之，本研究初步探討了在我國暴發(fā)流行的SARS-CoV-2病毒S蛋白區(qū)的分子特征，顯示該病毒的S蛋白并未發(fā)生明顯的變異，這為針對SARS-CoV-2病毒的藥物研發(fā)、特異性抗體的制備及疫苗的設(shè)計(jì)提供參考依據(jù)，且S蛋白區(qū)分子特征的持續(xù)監(jiān)測有助于SARS-CoV-2病毒的預(yù)防和控制。