楊婧 屈曉一 黨丹

膿毒癥是因機(jī)體對(duì)感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙，且可在感染后持續(xù)進(jìn)展，并最終導(dǎo)致促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的機(jī)制失衡、細(xì)胞凋亡和組織器官損傷等[1]。肺組織對(duì)于膿毒癥性損傷十分敏感，文獻(xiàn)報(bào)道大約有50%的膿毒癥患者會(huì)出現(xiàn)膿毒癥性急性肺損傷(sepsis induced acute lung injury, SI-ALI)[2]。膿毒癥后炎癥反應(yīng)是引起肺損傷的主要因素，研究發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)是炎癥反應(yīng)損傷的主要靶細(xì)胞[3]。一方面，過度的炎癥反應(yīng)會(huì)引起ECs損傷和肺功能障礙；另一方面，ECs的再生修復(fù)能力在炎癥反應(yīng)后可以被激活并具有修復(fù)肺損傷的作用[3]?；谝陨衔墨I(xiàn)報(bào)道，抑制膿毒癥后過度炎癥反應(yīng)可能具有促進(jìn)ECs發(fā)揮再生修復(fù)能力，并進(jìn)而改善SI-ALI后肺功能的潛能。新近的研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSCs)具有調(diào)控膿毒癥后免疫炎癥反應(yīng)的功能[4-5]。然而，MSCs是否能夠促進(jìn)SI-ALI后ECs發(fā)揮再生修復(fù)能力尚不清楚。鑒于此，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步探討了MSCs對(duì)SI-ALI大鼠肺ECs再生能力的作用。

資料與方法

一、 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

33只成年雄性SD大鼠(周齡：8～10周，體重：250～300g)由本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將這些大鼠飼養(yǎng)在本單位實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)環(huán)境：12小時(shí)一循環(huán)的晝夜節(jié)律，溫度21.0±2°C，濕度50～55%，并給予提供足夠的水和食物。其中3只大鼠用于獲取骨髓MSCs；另外30只用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將30只大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、SI-ALI組和SI-ALI+MSCs組，每組10只。本單位實(shí)驗(yàn)經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)開展此項(xiàng)研究，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作流程按照中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作指南進(jìn)行。

二、實(shí)驗(yàn)試劑

所用試劑包括：檢測(cè)MSCs表面分子的流式抗體CD29、CD45和CD90 (Abcam, UK)；構(gòu)建SI-ALI模型的LPS (Sigma，USA)；檢測(cè)炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α 相對(duì)應(yīng)mRNA表達(dá)水平的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriotion-polymerase chain reaction, RT-PCR) TRIzol 試劑盒(Invitrogen，USA)；BrdU (Sigma, USA)；檢測(cè)ECs再生能力的抗BrdU抗體(Abcam, UK)和抗VE鈣黏素抗體(Abcam, UK)；流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)所用胎牛血清、多聚甲醛、流式洗液等。

三、MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

利用水合氯醛將大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，暴露出雙側(cè)股骨和脛骨，祛除肌肉、肌腱、筋膜等軟組織。切斷股骨、脛骨兩端的干骺端，然后放置于含有10%胎牛血清、10%馬血清和1%青霉素/鏈霉素(Life Technologies, USA)的L-DMEM培養(yǎng)基中，利用注射器多次抽吸培養(yǎng)基以沖洗骨髓腔至到發(fā)白。收集所有沖洗液，在室溫、1200 r/min條件下離心8 min，祛掉上清液，保留離心后沉淀物。將分離的細(xì)胞均勻接種至含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素(Life Technologies, USA)的L-DMEM培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%純度時(shí)，離心后祛掉上清液，用PBS沖洗，胰酶消化后離心。將細(xì)胞沉淀再加入含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素(Life Technologies, USA)的L-DMEM培養(yǎng)瓶中，按 1 ∶2 比例傳代，每瓶細(xì)胞培養(yǎng)基體積為 5 mL。參照前述方法繼續(xù)傳代培養(yǎng)，取第 3 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。獲取第3代細(xì)胞后，利用FCM對(duì)其表面分子進(jìn)行鑒定，具體方法參見下文“1.7 流式細(xì)胞術(shù)”。

四、構(gòu)建SIC大鼠模型和不同組大鼠處理

將LPS在生理鹽水中溶解稀釋，以6mg/kg的劑量通過腹腔注射的方法構(gòu)建SIC大鼠模型。對(duì)照組大鼠只接受同等體積的生理鹽水腹腔注射。在SI-ALI+MSCs組，MSCs以106/mL的濃度在LPS注射后2小時(shí)之內(nèi)經(jīng)過尾靜脈注射給大鼠，每只大鼠注射劑量為2mL。為了檢測(cè)大鼠肺中ECs的再生能力，在處死大鼠前24小時(shí)，將BrdU以150mg/kg的濃度通過尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)。

五、肺組織標(biāo)本獲取

在LPS腹腔注射后72小時(shí)，并完成BrdU、MSCs等尾靜脈注射后將各組大鼠處死，分離出肺組織并在預(yù)冷生理鹽水中清洗干凈，分裝后在-80℃條件下保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

六、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)

利用RT-PCR檢測(cè)肺組織中炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α 相對(duì)應(yīng)mRNA的表達(dá)水平。具體步驟如下：首先利用TRIzol試劑并參照說明書提取出肺組織中的總RNA，RNA的量是利用260/280比值來確定的。每一個(gè)標(biāo)本取1ugRNA用來逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，每1ulcDNA被用來做RT-PCR檢測(cè)，做RT-PCR的內(nèi)參為β-actin。具體的操作步驟參照各種試劑的說明書進(jìn)行。PCR的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性20s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸7min。每份標(biāo)本檢測(cè)3次，最終取平均值作為最終結(jié)果。

七、流式細(xì)胞術(shù)

參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法，分離大鼠肺ECs，然后將ECs重懸于含有10%胎牛血清的流式洗液中，以制備ECs單細(xì)胞懸液。將檢測(cè)ECs再生能力的抗BrdU抗體(Abcam, UK)和抗VE鈣黏素抗體(Abcam, UK)參照試劑說明加入ECs單細(xì)胞懸液中。避光、室溫孵育2小時(shí)，離心后祛掉上清；加入反應(yīng)終止液，離心后再祛掉上清。而后再用PBS清洗3次，并重懸于含有10%胎牛血清的流式洗液中，在流式細(xì)胞儀(BD, USA)上進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)MSCs表面分子的方法參照前述方法進(jìn)行，所用抗體為兔抗大鼠CD44、CD56和CD90(Abcam, UK)。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)的形式表示, 利用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。三組間數(shù)據(jù)的總體比較采用單因素方差分析(ANOVA)，四組間的兩兩比較采用LSD-t方法。P<0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、分離出了大鼠骨髓來源的MSCs

參照前述實(shí)驗(yàn)方法，分離出了大鼠骨髓來源的MSCs，利用FCM對(duì)MSCs表面分子CD29、CD45和CD90進(jìn)行了分析，結(jié)果提示：CD29、CD90高表達(dá)，而CD45低表達(dá)，符合MSCs表面分子的表達(dá)特征(見表1)。

表1 MSCs表面分子表達(dá)率(%)

二、MSCs處理降低了SI-ALI大鼠肺組織中炎癥因子的表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，SI-ALI組大鼠肺組織中炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平升高。與SI-ALI組相比，SI-ALI+MSCs組大鼠肺組織中炎癥因子IL-1、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平降低(見表2)。

表2 MSCs處理降低了SI-ALI大鼠肺組織中炎癥因子的表達(dá)水平(相對(duì)表達(dá)量)。

三、MSCs處理提升了SI-ALI大鼠肺組織中ECs的再生能力

與對(duì)照組相比，SI-ALI組大鼠肺組織中ECs的再生能力提高。與SI-ALI組相比，SI-ALI+MSCs組大鼠肺組織中ECs的再生能力進(jìn)一步提高(見表3)。

表3 MSCs處理提升了SI-ALI大鼠肺組織中ECs的再生能力。

四、MSCs處理提升了SI-ALI大鼠的存活率

與對(duì)照組相比，SI-ALI組大鼠存活率明顯降低。與SI-ALI組相比，SI-ALI+MSCs組大鼠存活率明顯提升(見表4)。

表4 MSCs處理提升了SI-ALI大鼠的存活率(%)

討 論

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步探討了大鼠骨髓來源的MSCs對(duì)SI-ALI大鼠肺ECs再生能力的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MSCs減輕了SI-ALI大鼠肺組織中炎癥因子的表達(dá)水平、增強(qiáng)了ECs的再生能力，并提高了存活比率。鑒于MSCs具有調(diào)控膿毒癥后免疫炎癥反應(yīng)的功能[4-5]，MSCs可能是減輕膿毒癥后肺損傷、促進(jìn)肺ECs發(fā)揮再生修復(fù)能力并進(jìn)而降低SI-ALI患者死亡率的一種新方法。

目前的研究認(rèn)為，膿毒癥的自然病程包含兩個(gè)主要過程：早期的促炎過程和后期的抑炎過程，巨噬細(xì)胞在膿毒癥后炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[3]。巨噬細(xì)胞通過釋放抑炎因子或促炎因子調(diào)控膿毒癥的病理生理過程。促炎因子是造成膿毒癥后、器官損傷的主要因素。其中，肺組織對(duì)于膿毒癥性損傷十分敏感，文獻(xiàn)報(bào)道有50%左右的膿毒癥患者會(huì)出現(xiàn)SI-ALI[2]，且肺ECs是炎癥反應(yīng)損傷的主要靶細(xì)胞[3]。一方面，過度的炎癥反應(yīng)會(huì)引起ECs損傷和肺功能障礙；另一方面，ECs的再生修復(fù)能力在炎癥反應(yīng)后可以被激活并具有修復(fù)肺損傷的作用[3]。之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞釋放的促炎因子減少后，ECs的再生能力得以增強(qiáng)，且肺泡細(xì)胞、肺新生血管的數(shù)量均增多[6,7]。鑒于以上文獻(xiàn)報(bào)道，尋找可行措施抑制SI-ALI后炎癥反應(yīng)，可能是提升ECs再生修復(fù)能力并進(jìn)而降低肺損傷程度的有效策略。

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥反應(yīng)和緩解器官衰竭等諸多功能，這為探索利用MSCs治療膿毒癥提供了新思路。膿毒癥發(fā)生后，感染損傷相關(guān)分子與相應(yīng)識(shí)別受體相互結(jié)合，激活并促進(jìn)炎癥小體的組裝，從而介導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子。炎癥因子可以通過炎癥小體與更多的免疫細(xì)胞結(jié)合，從而產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡和氣管損傷[8]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs可以在動(dòng)物模型上減輕膿毒癥后炎癥反應(yīng)，并從而緩解器官損傷[9-10]。基于MSCs的功能和現(xiàn)有研究報(bào)道，本研究嘗試了利用MSCs抑制SI-ALI后炎癥反應(yīng)并進(jìn)而促進(jìn)ECs發(fā)揮再生修復(fù)能力和降低肺損傷程度的可能性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSCs減輕了SI-ALI大鼠肺組織中炎癥因子的表達(dá)水平、增強(qiáng)了ECs的再生能力，并提高了大鼠總體存活比率。雖然本研究初步觀察了MSCs對(duì)于SI-ALI后炎癥反應(yīng)和ECs再生能力的調(diào)控作用，其內(nèi)含的機(jī)制尚需要開展更多的研究進(jìn)行探討。

總之，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：MSCs減輕了SI-ALI大鼠肺組織中炎癥因子的表達(dá)水平、增強(qiáng)了ECs的再生能力，并提高了存活比率。MSCs可能是減輕膿毒癥后肺損傷、促進(jìn)肺ECs發(fā)揮再生修復(fù)能力并進(jìn)而降低SI-ALI患者死亡率的一種新策略。