顧健沛 王巍 李士博 王小喬

1. 蘭州現(xiàn)代職業(yè)學(xué)院，甘肅 蘭州730207；2. 甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州730030；3. 蘭州市食品藥品檢驗所，甘肅 蘭州730040

甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效［1-2］，主要化學(xué)成分為三萜類皂苷、黃酮及多糖類成分［3-5］，廣泛用于醫(yī)藥、保健、化妝品等產(chǎn)品中，近20 年來，由于對野生甘草過度拆挖，甘草野生資源瀕臨枯竭，為滿足市場的需要，國內(nèi)各原甘草產(chǎn)區(qū)開始大量種植甘草，但對甘草的質(zhì)量評價僅限于《中國藥典》的質(zhì)量要求，不能全信息反映甘草質(zhì)量，本研究采用HPLC 檢測手段，借鑒指紋圖譜的研究方法，對甘肅野生與栽培的甘草通過化學(xué)成分的指紋特征進行研究，經(jīng)聚類分析，形成直觀、量化的數(shù)字圖譜，為甘草藥材的鑒定及質(zhì)量控制提供了新的手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 Waters1200 液相色譜儀；島津LC-2010A 高效液相色譜儀；SPD-M10Avp 二極管陣列測器。超聲波清洗器（天津AUTOSCIENCE 公司）；sartorius225D 電子天平。甘草酸單銨鹽對照品（批號110731-201720），甘草苷對照品（批號11610-201607）購自中國藥品生物制品檢定研究院；乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為二級反滲透實驗用水，色譜柱：Hypersil C18（5um，4.6mm×250mm）；保護柱：Hypersil C18（5um，4mm×40mm）。甘草樣品：產(chǎn)自甘肅省各主產(chǎn)地區(qū)及寧夏等地，將樣品切頭取除1cm 以下至0.3cm 部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品來源 甘草產(chǎn)自甘肅省各主產(chǎn)地區(qū)及寧夏等地，北緯36 度線以上，13 個地區(qū)，19 批次甘草。見表1。

2.2 樣品的制備 取500g 樣品，粉碎成細粉，過80目篩，取約1g 甘草粉，精密稱定，置100mL 容量瓶中，加80%的甲醇適量，超聲提取40min，加80%的甲醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液用0.45μm 的微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含甘草酸銨0.2mg/mL 的溶液，即得（甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.0207）?；虬础吨袊幍洹?015 年版方法配置。取甘草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含甘草苷20μg/mL 的溶液，即得［1］。

2.3 實驗方法 采用梯度洗脫的方法以A 0.5%磷酸溶液、B 乙腈，二元梯度洗脫。柱溫：30℃，流速：0.8mL/min，進樣量：10μL，梯度洗脫系統(tǒng)見表2，色譜圖見圖1。

《中國藥典》2015 年版規(guī)定，含甘草苷（C21H22O9）不得少于0.50%，甘草酸（C42H62O16）不得少于2.0%。

2.4 甘草計算機模擬指紋圖譜的建立 取上述樣品，按照上述方法，對甘草樣品進行處理測定，以計量標準物甘草酸保留時間為1，計算各出峰與相對保留時間的關(guān)系做各樣品圖，其中03 酒泉樣品為不合格品，見表3，圖2-6。

在前置色譜條件中，10min 前為沖洗極性糖類成分，不計入分析范圍，即相對保留時間10/39=0.25，小于0.25 的計算峰不計入甘草指紋圖譜相對保留時間統(tǒng)計。

2.5 結(jié)果 將在特征相對保留時間0.47、0.49、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96 及1.00 峰面積歸類統(tǒng)計，相對保留時間面積表。見表3。

表1 甘草樣品采集表

表2 甘草梯度洗脫系統(tǒng)

3 討論

以合格甘草為標準基樣，進行分析，得出以相對保留時間為橫坐標，峰面積為縱坐標的數(shù)字圖譜；相對保留時間0.49 為甘草苷，相對保留時間1 為甘草酸，甘草應(yīng)具備相對保留時間為0.47、0.49、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96 及1.00 處7 個數(shù)字特征峰組成的甘草計算機模擬指紋圖譜，可用于甘草全信息質(zhì)量控制。

表3 甘草相對保留時間及峰面積表

圖1 甘草測定指紋圖譜

圖2 樣品17 慶陽（正寧）野生甘草計算機模擬指紋圖譜

圖3 樣品4 酒泉種植4 年甘草計算機模擬指紋圖譜

圖4 樣品19 寧夏同心種植4 年甘草計算機模擬指紋圖譜

圖5 樣品13 通渭野生甘草計算機模擬指紋圖譜

圖6 樣品3 酒泉種植3 年甘草計算機模擬指紋圖譜

甘草應(yīng)在以甘草酸為1 的保留時間，計算其他色譜峰，在相對保留時間為0.47、0.49、0.66、0.76、0.90～0.92、0.96、1.00 處有7 個特征峰。人工種植4 年甘草且種植緯度在北緯36 度以上，其甘草酸與甘草苷能同時達到《中國藥典》質(zhì)量要求，野生甘草與種植合格甘草有相同的數(shù)字特征峰。