李青 周天慧 莫瑞東 項(xiàng)曉剛 趙剛德 周惠娟 徐玉敏 蔡偉 王暉 謝青 賴榮陶
藥物性肝損傷(DILI)是指由各類處方或非處方的化學(xué)藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥(TCM)、天然藥(NM)、保健品(HP)、膳食補(bǔ)充劑(DS)及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等所誘發(fā)的肝損傷[1]。近年來,隨著臨床醫(yī)師和公眾對(duì)藥物性肝損傷的重視和藥物不良反應(yīng)報(bào)告系統(tǒng)的日益完善,其病例報(bào)告數(shù)量正在逐年增加,其中約20%的藥物性肝損傷病例發(fā)展為慢性化,并具有類似自身免疫性肝炎的臨床表現(xiàn)。目前尚無鑒別DILI和AIH的特異性生物標(biāo)記物,在臨床上鑒別二者存在困難。兩種疾病的治療原則不同,尋找DILI早期預(yù)警信號(hào)對(duì)DILI臨床診斷具有重要意義。
固有淋巴細(xì)胞(ILCs)是一群參與固有免疫的異質(zhì)性淋巴細(xì)胞,介導(dǎo)局部免疫應(yīng)答,發(fā)揮早期免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用。此外,ILCs 還可通過協(xié)調(diào)獲得性免疫細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)全身免疫應(yīng)答[2]。 根據(jù)ILCs細(xì)胞表型和功能特點(diǎn),可將ILCs 分為3類:ILC1、ILC2 以及ILC3。研究表明,ILC3與肝臟炎癥疾病相關(guān)[3],在HBV肝纖維化研究中,肝臟ILC3的活化促進(jìn)肝星形細(xì)胞的活化,加重炎癥損傷。在藥物性肝損傷研究中,目前尚無關(guān)于ILC3細(xì)胞的研究報(bào)道,我們前期的研究結(jié)果顯示,在藥物性肝損傷患者的炎癥反應(yīng)中,患者肝內(nèi)IL-22具有潛在保護(hù)效應(yīng)。ILCs可分泌IL-22,本研究是基于我們前期的工作基礎(chǔ),監(jiān)測藥物性肝損傷患者外周血中ILC3的頻數(shù)改變,為進(jìn)一步闡明DILI的發(fā)病機(jī)制及篩選早期預(yù)警分子奠定基礎(chǔ)。
一、研究對(duì)象
選取2019年1月至2019年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科連續(xù)收治的DILI患者30例,AIH患者10例,健康對(duì)照(HC)10例。經(jīng)瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并征得患者同意,簽署知情同意書,記錄患者的臨床資料及相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,收集外周血,分離并保存血清。
藥物性肝損傷患者的入組標(biāo)準(zhǔn),參考 2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)藥物性肝病學(xué)組頒發(fā)的《藥物性肝損傷診治指南》,首次發(fā)現(xiàn)肝生化指標(biāo)(ALT、AST、TBil、ALP等)異常7 d內(nèi);或撤除可疑藥物后,肝生化指標(biāo)反復(fù)異常6個(gè)月以上。AIH組納入標(biāo)準(zhǔn)參考2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)制訂的《自身免疫性肝炎診斷和治療共識(shí)》。
排除標(biāo)準(zhǔn):各型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、原發(fā)性膽汁性膽管炎、肝豆?fàn)詈俗冃?、? 抗胰蛋白酶缺乏癥、血色病等各類肝膽疾病[4-5]。
二、臨床資料采集
采集臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù),包括年齡、性別、病史和血常規(guī)、肝功能等。
三、實(shí)驗(yàn)方法
分別留取各組患者外周血3 mL,采用Ficoll密度梯度離心法,獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)PBS洗滌,1 200 rpm/min離心5 min,棄上清,PBS重懸,配置40 μL細(xì)胞懸液,加入抗Lineage表面抗體,CD127-APC(17-1278-42,eBioscience)和PE-Cyanine7-NKP46(25-3359-42,eBioscience)流式熒光抗體混合液,進(jìn)行膜表面分子??筶ineage包括如下抗體:CD3-FITC (35-0038-T100,Tonbo), CD19-FITC (35-0199-T100,Tonbo),CD56-FITC(11-0566-42, eBioscience),CD14(35-0149-T100,Tonbo),HLA-DR(11-9952-42,eBioscience),CD34-FITC (11-0349-42,eBioscience),用于排除T、B、NK、單核、樹突、造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞,封閉相應(yīng)FcγR,室溫孵育20 min;分別加入1 mL PBS洗滌,1 200 rpm/min離心5 min,棄上清,加入200 μL含1%多聚甲醛的PBS重懸細(xì)胞,BECKMAN CytoFLEX 流式細(xì)胞儀檢測外周血PBMC中Lin-CD127+NKP46+ILC3細(xì)胞頻數(shù)。
四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
使用SPSS 16.0軟件和Graphpad 5.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料使用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn),多組間比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)或非參數(shù)檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
一、各組臨床資料比較
30例DILI患者、10例AIH患者的臨床數(shù)據(jù)納入分析,另納入健康對(duì)照(HC)組10例。各組間性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),DILI組及AIH組患者的ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil水平均明顯高于健康對(duì)照組(P<0. 01),三組間PT及PLT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DILI組和AIH組間ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。
表1 健康人及各組患者一般情況及ILC、NKP46+ILC3比較
二、各組人群外周血PBMC中ILCs及NKP46+ILC3平均細(xì)胞頻數(shù)百分比的比較
PBMC中ILCs平均細(xì)胞頻數(shù)百分比在各組中存在差異。流式檢測發(fā)現(xiàn)DILI組及AIH組中ILCs的細(xì)胞頻數(shù)分別為0.060%±0.006%和0.074%±0.009%,均顯著低于HC健康組(0.162%±0.015%,P<0.001);DILI組和AIH組間的ILCs平均細(xì)胞頻數(shù)百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03,見圖1)。
PBMC中NKp46+ILC3的平均細(xì)胞頻數(shù)百分比在各組中亦存在顯著性差異,DILI組和AIH組的NKp46+ILC3平均細(xì)胞頻數(shù)百分比分別為0.011%±0.002%和0.019%±0.004%,均顯著低于HC健康組(0.041%±0.003%,P<0.001);且DILI組的NKp46+ILC3的平均細(xì)胞頻數(shù)百分比顯著低于AIH組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著患者各項(xiàng)肝功能指標(biāo)的逐漸恢復(fù),DILI組NKp46+ILC3平均細(xì)胞頻數(shù)百分比也逐漸升高,AIH組NKp46+ILC3平均細(xì)胞頻數(shù)百分比在治療的相同時(shí)間段內(nèi)無顯著變化(圖1)。
圖1 各組人群外周血PBMC中ILCs及NKp46+ILC3平均細(xì)胞頻數(shù)比較
三、ILCs及NKp46+ILC3隨病情進(jìn)展的相應(yīng)變化
動(dòng)態(tài)收集DILI組及AIH組的3例患者PBMC,檢測患者入院7、14、28 d ILCs及NKp46+ILC3的細(xì)胞頻數(shù)百分比。發(fā)現(xiàn)隨著患者肝功能的逐漸恢復(fù),DILI組的ILCs平均細(xì)胞頻數(shù)百分比逐漸升高,而AIH組無顯著變化。我們發(fā)現(xiàn)雖然DILI組ILCs總頻數(shù)隨著疾病的恢復(fù)而逐漸升高,但NKp46+ILC3在ILCs中的百分比基本不變, NKp46+ILC3在PBMC中的細(xì)胞頻數(shù)百分比逐漸升高(圖2)。
圖2 DILI及AIH患者外周血中ILCs及NKp46+ILC3動(dòng)態(tài)變化
四、NKp46+ILC3細(xì)胞頻數(shù)與DILI患者肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析
DILI患者NKp46+ILC3平均細(xì)胞頻數(shù)百分比與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT),血小板(PLT)等肝功能水平無相關(guān)性(P>0.05),與總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)呈負(fù)相關(guān)性(圖3)。
圖3 NKp46+ILC3細(xì)胞頻數(shù)與DILI患者肝功能指標(biāo)的相關(guān)性分析
DILI與AIH因其臨床表現(xiàn)類似,且多見于女性,兩者血清學(xué)改變和病理學(xué)特征相近,一直是臨床診斷的一大難題。又因兩者的治療原則不同,使得對(duì)其進(jìn)行鑒別診斷尤為重要。當(dāng)DILI患者存在自身免疫性特征時(shí),通常需要對(duì)其進(jìn)行肝臟活檢,肝細(xì)胞膽汁淤積和匯管區(qū)中性粒細(xì)胞浸潤提示DILI。在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn),DILI患者匯管區(qū)CD8+T細(xì)胞浸潤明顯,而AIH患者匯管區(qū)浸潤主要為成熟B細(xì)胞[6-7]。
近年來的研究發(fā)現(xiàn)了一些診斷DILI的新型生物標(biāo)志物,如高遷移率族蛋白1(HMGB1)、細(xì)胞凋亡指標(biāo)keratin-18(cc)和細(xì)胞壞死指標(biāo)keratin-18(FL)、與肝損傷相關(guān)的miR-122、miR-192,線粒體損傷標(biāo)志物
GLDH、線粒體DNA、HLA基因多態(tài)性等,然而這些生物標(biāo)記物是否可運(yùn)用到臨床有待進(jìn)一步臨床研究證實(shí)[8]。ILCs是一類新近發(fā)現(xiàn)、具有與輔助性T細(xì)胞相似表型和功能的“鏡像細(xì)胞”, 但缺乏T、B細(xì)胞的抗原特異性受體。作為IL-22的主要來源,ILC3具有組織修復(fù)、重塑及維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能。ILCs是分泌效應(yīng)細(xì)胞因子IL-22、IL-17、IFNγ、IL-5、IL-13的主要細(xì)胞,參與組織的修復(fù)以及防御病原體的入侵。在正常微環(huán)境中,ILC3s表達(dá)量較少,但能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定;當(dāng)組織遭到損害時(shí),ILCs迅速啟動(dòng)免疫應(yīng)答,ILC3s表達(dá)量增加,分泌IL-22、IL-17及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF),發(fā)揮組織保護(hù)作用并啟動(dòng)修復(fù)功能[9]。
我們前期工作發(fā)現(xiàn)IL-22在藥物性肝損傷(DILI)及慢性乙型肝炎中發(fā)揮肝保護(hù)效應(yīng),但目前尚無ILCs在DILI中的研究報(bào)道[10]。新近的研究成果提示ILC3細(xì)胞及其分泌的IL-22在肝纖維化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等多種疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[11]。在本研究中發(fā)現(xiàn),DILI患者外周血NKp46+ILC3細(xì)胞頻數(shù)顯著低于AIH患者。雖然DILI患者發(fā)病早期的氨基轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素等肝功能指標(biāo)的高低與ILCs及NKp46+ILC3的細(xì)胞頻數(shù)無相關(guān)性,但隨著肝功能的逐漸恢復(fù),外周血NKp46+ILC3頻數(shù)亦逐漸升高,而AIH患者無顯著性改變,表明在急性肝損傷后,NKp46+ILC3細(xì)胞頻數(shù)可能發(fā)揮肝細(xì)胞再生、修復(fù)作用,而在慢性自身免疫性肝病中,肝細(xì)胞修復(fù)能力較弱。本研究的一大限制是動(dòng)態(tài)分析的患者例數(shù)較少,異質(zhì)性大,需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步比較。綜上所述,外周血NKp46+ILC3細(xì)胞頻數(shù)在DILI和AIH患者中存在差異,將來有關(guān)NKp46+ILC3在DILI中的臨床診斷價(jià)值有待于更大樣本量的多中心臨床研究予驗(yàn)證。