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        3型固有淋巴細胞在藥物性肝損傷及自身免疫性肝炎患者中的表達具有潛在鑒別價值

        2020-09-04 06:12:00李青周天慧莫瑞東項曉剛趙剛德周惠娟徐玉敏蔡偉王暉謝青賴榮陶
        肝臟 2020年8期
        關(guān)鍵詞:藥物性頻數(shù)百分比

        李青 周天慧 莫瑞東 項曉剛 趙剛德 周惠娟 徐玉敏 蔡偉 王暉 謝青 賴榮陶

        藥物性肝損傷(DILI)是指由各類處方或非處方的化學(xué)藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥(TCM)、天然藥(NM)、保健品(HP)、膳食補充劑(DS)及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等所誘發(fā)的肝損傷[1]。近年來,隨著臨床醫(yī)師和公眾對藥物性肝損傷的重視和藥物不良反應(yīng)報告系統(tǒng)的日益完善,其病例報告數(shù)量正在逐年增加,其中約20%的藥物性肝損傷病例發(fā)展為慢性化,并具有類似自身免疫性肝炎的臨床表現(xiàn)。目前尚無鑒別DILI和AIH的特異性生物標記物,在臨床上鑒別二者存在困難。兩種疾病的治療原則不同,尋找DILI早期預(yù)警信號對DILI臨床診斷具有重要意義。

        固有淋巴細胞(ILCs)是一群參與固有免疫的異質(zhì)性淋巴細胞,介導(dǎo)局部免疫應(yīng)答,發(fā)揮早期免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用。此外,ILCs 還可通過協(xié)調(diào)獲得性免疫細胞的功能調(diào)節(jié)全身免疫應(yīng)答[2]。 根據(jù)ILCs細胞表型和功能特點,可將ILCs 分為3類:ILC1、ILC2 以及ILC3。研究表明,ILC3與肝臟炎癥疾病相關(guān)[3],在HBV肝纖維化研究中,肝臟ILC3的活化促進肝星形細胞的活化,加重炎癥損傷。在藥物性肝損傷研究中,目前尚無關(guān)于ILC3細胞的研究報道,我們前期的研究結(jié)果顯示,在藥物性肝損傷患者的炎癥反應(yīng)中,患者肝內(nèi)IL-22具有潛在保護效應(yīng)。ILCs可分泌IL-22,本研究是基于我們前期的工作基礎(chǔ),監(jiān)測藥物性肝損傷患者外周血中ILC3的頻數(shù)改變,為進一步闡明DILI的發(fā)病機制及篩選早期預(yù)警分子奠定基礎(chǔ)。

        資料和方法

        一、研究對象

        選取2019年1月至2019年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科連續(xù)收治的DILI患者30例,AIH患者10例,健康對照(HC)10例。經(jīng)瑞金醫(yī)院倫理委員會批準,并征得患者同意,簽署知情同意書,記錄患者的臨床資料及相關(guān)實驗室檢查結(jié)果,收集外周血,分離并保存血清。

        藥物性肝損傷患者的入組標準,參考 2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會藥物性肝病學(xué)組頒發(fā)的《藥物性肝損傷診治指南》,首次發(fā)現(xiàn)肝生化指標(ALT、AST、TBil、ALP等)異常7 d內(nèi);或撤除可疑藥物后,肝生化指標反復(fù)異常6個月以上。AIH組納入標準參考2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會和中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會制訂的《自身免疫性肝炎診斷和治療共識》。

        排除標準:各型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、原發(fā)性膽汁性膽管炎、肝豆狀核變性、α1 抗胰蛋白酶缺乏癥、血色病等各類肝膽疾病[4-5]。

        二、臨床資料采集

        采集臨床和實驗室數(shù)據(jù),包括年齡、性別、病史和血常規(guī)、肝功能等。

        三、實驗方法

        分別留取各組患者外周血3 mL,采用Ficoll密度梯度離心法,獲取外周血單個核細胞,經(jīng)PBS洗滌,1 200 rpm/min離心5 min,棄上清,PBS重懸,配置40 μL細胞懸液,加入抗Lineage表面抗體,CD127-APC(17-1278-42,eBioscience)和PE-Cyanine7-NKP46(25-3359-42,eBioscience)流式熒光抗體混合液,進行膜表面分子??筶ineage包括如下抗體:CD3-FITC (35-0038-T100,Tonbo), CD19-FITC (35-0199-T100,Tonbo),CD56-FITC(11-0566-42, eBioscience),CD14(35-0149-T100,Tonbo),HLA-DR(11-9952-42,eBioscience),CD34-FITC (11-0349-42,eBioscience),用于排除T、B、NK、單核、樹突、造血干細胞和祖細胞,封閉相應(yīng)FcγR,室溫孵育20 min;分別加入1 mL PBS洗滌,1 200 rpm/min離心5 min,棄上清,加入200 μL含1%多聚甲醛的PBS重懸細胞,BECKMAN CytoFLEX 流式細胞儀檢測外周血PBMC中Lin-CD127+NKP46+ILC3細胞頻數(shù)。

        四、統(tǒng)計學(xué)方法

        使用SPSS 16.0軟件和Graphpad 5.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量資料使用均值±標準誤表示,兩組間比較使用獨立樣本t檢驗或非參數(shù)檢驗,多組間比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)或非參數(shù)檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        一、各組臨床資料比較

        30例DILI患者、10例AIH患者的臨床數(shù)據(jù)納入分析,另納入健康對照(HC)組10例。各組間性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),DILI組及AIH組患者的ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil水平均明顯高于健康對照組(P<0. 01),三組間PT及PLT差異無統(tǒng)計學(xué)意義。DILI組和AIH組間ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。

        表1 健康人及各組患者一般情況及ILC、NKP46+ILC3比較

        二、各組人群外周血PBMC中ILCs及NKP46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比的比較

        PBMC中ILCs平均細胞頻數(shù)百分比在各組中存在差異。流式檢測發(fā)現(xiàn)DILI組及AIH組中ILCs的細胞頻數(shù)分別為0.060%±0.006%和0.074%±0.009%,均顯著低于HC健康組(0.162%±0.015%,P<0.001);DILI組和AIH組間的ILCs平均細胞頻數(shù)百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03,見圖1)。

        PBMC中NKp46+ILC3的平均細胞頻數(shù)百分比在各組中亦存在顯著性差異,DILI組和AIH組的NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比分別為0.011%±0.002%和0.019%±0.004%,均顯著低于HC健康組(0.041%±0.003%,P<0.001);且DILI組的NKp46+ILC3的平均細胞頻數(shù)百分比顯著低于AIH組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著患者各項肝功能指標的逐漸恢復(fù),DILI組NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比也逐漸升高,AIH組NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比在治療的相同時間段內(nèi)無顯著變化(圖1)。

        圖1 各組人群外周血PBMC中ILCs及NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)比較

        三、ILCs及NKp46+ILC3隨病情進展的相應(yīng)變化

        動態(tài)收集DILI組及AIH組的3例患者PBMC,檢測患者入院7、14、28 d ILCs及NKp46+ILC3的細胞頻數(shù)百分比。發(fā)現(xiàn)隨著患者肝功能的逐漸恢復(fù),DILI組的ILCs平均細胞頻數(shù)百分比逐漸升高,而AIH組無顯著變化。我們發(fā)現(xiàn)雖然DILI組ILCs總頻數(shù)隨著疾病的恢復(fù)而逐漸升高,但NKp46+ILC3在ILCs中的百分比基本不變, NKp46+ILC3在PBMC中的細胞頻數(shù)百分比逐漸升高(圖2)。

        圖2 DILI及AIH患者外周血中ILCs及NKp46+ILC3動態(tài)變化

        四、NKp46+ILC3細胞頻數(shù)與DILI患者肝功能指標的相關(guān)性分析

        DILI患者NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT),血小板(PLT)等肝功能水平無相關(guān)性(P>0.05),與總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)呈負相關(guān)性(圖3)。

        圖3 NKp46+ILC3細胞頻數(shù)與DILI患者肝功能指標的相關(guān)性分析

        討 論

        DILI與AIH因其臨床表現(xiàn)類似,且多見于女性,兩者血清學(xué)改變和病理學(xué)特征相近,一直是臨床診斷的一大難題。又因兩者的治療原則不同,使得對其進行鑒別診斷尤為重要。當DILI患者存在自身免疫性特征時,通常需要對其進行肝臟活檢,肝細胞膽汁淤積和匯管區(qū)中性粒細胞浸潤提示DILI。在另一項研究中發(fā)現(xiàn),DILI患者匯管區(qū)CD8+T細胞浸潤明顯,而AIH患者匯管區(qū)浸潤主要為成熟B細胞[6-7]。

        近年來的研究發(fā)現(xiàn)了一些診斷DILI的新型生物標志物,如高遷移率族蛋白1(HMGB1)、細胞凋亡指標keratin-18(cc)和細胞壞死指標keratin-18(FL)、與肝損傷相關(guān)的miR-122、miR-192,線粒體損傷標志物

        GLDH、線粒體DNA、HLA基因多態(tài)性等,然而這些生物標記物是否可運用到臨床有待進一步臨床研究證實[8]。ILCs是一類新近發(fā)現(xiàn)、具有與輔助性T細胞相似表型和功能的“鏡像細胞”, 但缺乏T、B細胞的抗原特異性受體。作為IL-22的主要來源,ILC3具有組織修復(fù)、重塑及維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能。ILCs是分泌效應(yīng)細胞因子IL-22、IL-17、IFNγ、IL-5、IL-13的主要細胞,參與組織的修復(fù)以及防御病原體的入侵。在正常微環(huán)境中,ILC3s表達量較少,但能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定;當組織遭到損害時,ILCs迅速啟動免疫應(yīng)答,ILC3s表達量增加,分泌IL-22、IL-17及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF),發(fā)揮組織保護作用并啟動修復(fù)功能[9]。

        我們前期工作發(fā)現(xiàn)IL-22在藥物性肝損傷(DILI)及慢性乙型肝炎中發(fā)揮肝保護效應(yīng),但目前尚無ILCs在DILI中的研究報道[10]。新近的研究成果提示ILC3細胞及其分泌的IL-22在肝纖維化、類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等多種疾病進展中發(fā)揮重要作用[11]。在本研究中發(fā)現(xiàn),DILI患者外周血NKp46+ILC3細胞頻數(shù)顯著低于AIH患者。雖然DILI患者發(fā)病早期的氨基轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素等肝功能指標的高低與ILCs及NKp46+ILC3的細胞頻數(shù)無相關(guān)性,但隨著肝功能的逐漸恢復(fù),外周血NKp46+ILC3頻數(shù)亦逐漸升高,而AIH患者無顯著性改變,表明在急性肝損傷后,NKp46+ILC3細胞頻數(shù)可能發(fā)揮肝細胞再生、修復(fù)作用,而在慢性自身免疫性肝病中,肝細胞修復(fù)能力較弱。本研究的一大限制是動態(tài)分析的患者例數(shù)較少,異質(zhì)性大,需擴大樣本進一步比較。綜上所述,外周血NKp46+ILC3細胞頻數(shù)在DILI和AIH患者中存在差異,將來有關(guān)NKp46+ILC3在DILI中的臨床診斷價值有待于更大樣本量的多中心臨床研究予驗證。

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