李青 周天慧 莫瑞東 項曉剛 趙剛德 周惠娟 徐玉敏 蔡偉 王暉 謝青 賴榮陶

藥物性肝損傷(DILI)是指由各類處方或非處方的化學(xué)藥物、生物制劑、傳統(tǒng)中藥(TCM)、天然藥(NM)、保健品(HP)、膳食補充劑(DS)及其代謝產(chǎn)物乃至輔料等所誘發(fā)的肝損傷[1]。近年來，隨著臨床醫(yī)師和公眾對藥物性肝損傷的重視和藥物不良反應(yīng)報告系統(tǒng)的日益完善，其病例報告數(shù)量正在逐年增加，其中約20%的藥物性肝損傷病例發(fā)展為慢性化，并具有類似自身免疫性肝炎的臨床表現(xiàn)。目前尚無鑒別DILI和AIH的特異性生物標記物，在臨床上鑒別二者存在困難。兩種疾病的治療原則不同，尋找DILI早期預(yù)警信號對DILI臨床診斷具有重要意義。

固有淋巴細胞(ILCs)是一群參與固有免疫的異質(zhì)性淋巴細胞，介導(dǎo)局部免疫應(yīng)答，發(fā)揮早期免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用。此外，ILCs 還可通過協(xié)調(diào)獲得性免疫細胞的功能調(diào)節(jié)全身免疫應(yīng)答[2]。 根據(jù)ILCs細胞表型和功能特點，可將ILCs 分為3類：ILC1、ILC2 以及ILC3。研究表明，ILC3與肝臟炎癥疾病相關(guān)[3]，在HBV肝纖維化研究中，肝臟ILC3的活化促進肝星形細胞的活化，加重炎癥損傷。在藥物性肝損傷研究中，目前尚無關(guān)于ILC3細胞的研究報道，我們前期的研究結(jié)果顯示，在藥物性肝損傷患者的炎癥反應(yīng)中，患者肝內(nèi)IL-22具有潛在保護效應(yīng)。ILCs可分泌IL-22，本研究是基于我們前期的工作基礎(chǔ)，監(jiān)測藥物性肝損傷患者外周血中ILC3的頻數(shù)改變，為進一步闡明DILI的發(fā)病機制及篩選早期預(yù)警分子奠定基礎(chǔ)。

資料和方法

一、研究對象

選取2019年1月至2019年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院感染科連續(xù)收治的DILI患者30例，AIH患者10例，健康對照(HC)10例。經(jīng)瑞金醫(yī)院倫理委員會批準，并征得患者同意，簽署知情同意書，記錄患者的臨床資料及相關(guān)實驗室檢查結(jié)果，收集外周血，分離并保存血清。

藥物性肝損傷患者的入組標準，參考 2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會藥物性肝病學(xué)組頒發(fā)的《藥物性肝損傷診治指南》，首次發(fā)現(xiàn)肝生化指標(ALT、AST、TBil、ALP等)異常7 d內(nèi)；或撤除可疑藥物后，肝生化指標反復(fù)異常6個月以上。AIH組納入標準參考2015年中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會消化病學(xué)分會和中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會制訂的《自身免疫性肝炎診斷和治療共識》。

排除標準：各型病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、原發(fā)性膽汁性膽管炎、肝豆狀核變性、α1 抗胰蛋白酶缺乏癥、血色病等各類肝膽疾病[4-5]。

二、臨床資料采集

采集臨床和實驗室數(shù)據(jù)，包括年齡、性別、病史和血常規(guī)、肝功能等。

三、實驗方法

分別留取各組患者外周血3 mL，采用Ficoll密度梯度離心法，獲取外周血單個核細胞，經(jīng)PBS洗滌，1 200 rpm/min離心5 min，棄上清，PBS重懸，配置40 μL細胞懸液，加入抗Lineage表面抗體，CD127-APC(17-1278-42，eBioscience)和PE-Cyanine7-NKP46(25-3359-42，eBioscience)流式熒光抗體混合液，進行膜表面分子?？筶ineage包括如下抗體：CD3-FITC (35-0038-T100，Tonbo), CD19-FITC (35-0199-T100，Tonbo)，CD56-FITC(11-0566-42, eBioscience)，CD14(35-0149-T100,Tonbo)，HLA-DR(11-9952-42，eBioscience)，CD34-FITC (11-0349-42，eBioscience)，用于排除T、B、NK、單核、樹突、造血干細胞和祖細胞，封閉相應(yīng)FcγR，室溫孵育20 min；分別加入1 mL PBS洗滌，1 200 rpm/min離心5 min，棄上清，加入200 μL含1%多聚甲醛的PBS重懸細胞，BECKMAN CytoFLEX 流式細胞儀檢測外周血PBMC中Lin-CD127+NKP46+ILC3細胞頻數(shù)。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 16.0軟件和Graphpad 5.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量資料使用均值±標準誤表示，兩組間比較使用獨立樣本t檢驗或非參數(shù)檢驗，多組間比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)或非參數(shù)檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組臨床資料比較

30例DILI患者、10例AIH患者的臨床數(shù)據(jù)納入分析，另納入健康對照(HC)組10例。各組間性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，DILI組及AIH組患者的ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil水平均明顯高于健康對照組(P<0. 01)，三組間PT及PLT差異無統(tǒng)計學(xué)意義。DILI組和AIH組間ALT、AST、ALP、γ-GT、TBil、DBil，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 健康人及各組患者一般情況及ILC、NKP46+ILC3比較

二、各組人群外周血PBMC中ILCs及NKP46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比的比較

PBMC中ILCs平均細胞頻數(shù)百分比在各組中存在差異。流式檢測發(fā)現(xiàn)DILI組及AIH組中ILCs的細胞頻數(shù)分別為0.060%±0.006%和0.074%±0.009%，均顯著低于HC健康組(0.162%±0.015%，P<0.001)；DILI組和AIH組間的ILCs平均細胞頻數(shù)百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.03，見圖1)。

PBMC中NKp46+ILC3的平均細胞頻數(shù)百分比在各組中亦存在顯著性差異，DILI組和AIH組的NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比分別為0.011%±0.002%和0.019%±0.004%，均顯著低于HC健康組(0.041%±0.003%，P<0.001)；且DILI組的NKp46+ILC3的平均細胞頻數(shù)百分比顯著低于AIH組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。隨著患者各項肝功能指標的逐漸恢復(fù)，DILI組NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比也逐漸升高，AIH組NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比在治療的相同時間段內(nèi)無顯著變化(圖1)。

圖1 各組人群外周血PBMC中ILCs及NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)比較

三、ILCs及NKp46+ILC3隨病情進展的相應(yīng)變化

動態(tài)收集DILI組及AIH組的3例患者PBMC，檢測患者入院7、14、28 d ILCs及NKp46+ILC3的細胞頻數(shù)百分比。發(fā)現(xiàn)隨著患者肝功能的逐漸恢復(fù)，DILI組的ILCs平均細胞頻數(shù)百分比逐漸升高，而AIH組無顯著變化。我們發(fā)現(xiàn)雖然DILI組ILCs總頻數(shù)隨著疾病的恢復(fù)而逐漸升高，但NKp46+ILC3在ILCs中的百分比基本不變， NKp46+ILC3在PBMC中的細胞頻數(shù)百分比逐漸升高(圖2)。

圖2 DILI及AIH患者外周血中ILCs及NKp46+ILC3動態(tài)變化

四、NKp46+ILC3細胞頻數(shù)與DILI患者肝功能指標的相關(guān)性分析

DILI患者NKp46+ILC3平均細胞頻數(shù)百分比與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT),血小板(PLT)等肝功能水平無相關(guān)性(P>0.05)，與總膽紅素(TBil)、直接膽紅素(DBil)呈負相關(guān)性(圖3)。

圖3 NKp46+ILC3細胞頻數(shù)與DILI患者肝功能指標的相關(guān)性分析

討 論

DILI與AIH因其臨床表現(xiàn)類似，且多見于女性，兩者血清學(xué)改變和病理學(xué)特征相近，一直是臨床診斷的一大難題。又因兩者的治療原則不同，使得對其進行鑒別診斷尤為重要。當DILI患者存在自身免疫性特征時，通常需要對其進行肝臟活檢，肝細胞膽汁淤積和匯管區(qū)中性粒細胞浸潤提示DILI。在另一項研究中發(fā)現(xiàn)，DILI患者匯管區(qū)CD8+T細胞浸潤明顯，而AIH患者匯管區(qū)浸潤主要為成熟B細胞[6-7]。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)了一些診斷DILI的新型生物標志物，如高遷移率族蛋白1(HMGB1)、細胞凋亡指標keratin-18(cc)和細胞壞死指標keratin-18(FL)、與肝損傷相關(guān)的miR-122、miR-192，線粒體損傷標志物

GLDH、線粒體DNA、HLA基因多態(tài)性等，然而這些生物標記物是否可運用到臨床有待進一步臨床研究證實[8]。ILCs是一類新近發(fā)現(xiàn)、具有與輔助性T細胞相似表型和功能的“鏡像細胞”, 但缺乏T、B細胞的抗原特異性受體。作為IL-22的主要來源，ILC3具有組織修復(fù)、重塑及維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的功能。ILCs是分泌效應(yīng)細胞因子IL-22、IL-17、IFNγ、IL-5、IL-13的主要細胞，參與組織的修復(fù)以及防御病原體的入侵。在正常微環(huán)境中，ILC3s表達量較少，但能維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；當組織遭到損害時，ILCs迅速啟動免疫應(yīng)答，ILC3s表達量增加，分泌IL-22、IL-17及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，發(fā)揮組織保護作用并啟動修復(fù)功能[9]。

我們前期工作發(fā)現(xiàn)IL-22在藥物性肝損傷(DILI)及慢性乙型肝炎中發(fā)揮肝保護效應(yīng)，但目前尚無ILCs在DILI中的研究報道[10]。新近的研究成果提示ILC3細胞及其分泌的IL-22在肝纖維化、類風濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等多種疾病進展中發(fā)揮重要作用[11]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，DILI患者外周血NKp46+ILC3細胞頻數(shù)顯著低于AIH患者。雖然DILI患者發(fā)病早期的氨基轉(zhuǎn)氨酶、總膽紅素等肝功能指標的高低與ILCs及NKp46+ILC3的細胞頻數(shù)無相關(guān)性，但隨著肝功能的逐漸恢復(fù)，外周血NKp46+ILC3頻數(shù)亦逐漸升高，而AIH患者無顯著性改變，表明在急性肝損傷后，NKp46+ILC3細胞頻數(shù)可能發(fā)揮肝細胞再生、修復(fù)作用，而在慢性自身免疫性肝病中，肝細胞修復(fù)能力較弱。本研究的一大限制是動態(tài)分析的患者例數(shù)較少，異質(zhì)性大，需擴大樣本進一步比較。綜上所述，外周血NKp46+ILC3細胞頻數(shù)在DILI和AIH患者中存在差異，將來有關(guān)NKp46+ILC3在DILI中的臨床診斷價值有待于更大樣本量的多中心臨床研究予驗證。