楊 凡 張俊楠 王金全 呂宗浩 劉 杰 鄭云朵

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)是一種具有類雌激素作用的非甾醇類真菌毒素，主要由鐮刀菌屬如禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)、三線鐮刀菌(Fusariumtricinctum)等真菌產(chǎn)生。ZEN是全球污染程度最嚴(yán)重、污染范圍最廣泛的真菌毒素之一，在玉米、小麥、大麥、大豆、高粱、大米等飼料原料以及大部分農(nóng)副產(chǎn)品中均可被檢出[1-3]。ZEN及其衍生物的結(jié)構(gòu)與內(nèi)源性雌激素17β-雌二醇十分相似，因此能夠競爭性與雌激素受體結(jié)合，從而引發(fā)一系列類雌激素效應(yīng)，對母豬等雌性哺乳動物尤為明顯，主要中毒癥狀表現(xiàn)為陰戶紅腫、假發(fā)情等，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎和陰道脫垂[4,5]。此外，ZEN還具有肝腎毒性、免疫毒性和潛在致癌性[2]。ZEN可以通過食物鏈進(jìn)入動物或人體內(nèi)，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。

為了減少飼料及其原料中的ZEN，提高畜產(chǎn)品安全，降低毒素污染造成的經(jīng)濟(jì)損失，物理、化學(xué)和生物轉(zhuǎn)化的方法已經(jīng)在不斷的嘗試和改進(jìn)。物理(清洗、吸附劑、輻射等)和化學(xué)(堿性水解、氧化等)脫毒法往往因其效果不穩(wěn)定、容易造成營養(yǎng)缺失、飼料適口性差、成本昂貴等缺點(diǎn)，很難應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐[6-8]。利用微生物或酶將毒素轉(zhuǎn)化為無毒或低毒代謝產(chǎn)物的生物轉(zhuǎn)化法則具有高效專一、對環(huán)境污染小、不破壞飼料營養(yǎng)成分等優(yōu)點(diǎn)[9]。地球上的微生物種類豐富，數(shù)量龐大，自然界中總能找到相應(yīng)降解某種或幾種毒素的微生物。目前為止，國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種能夠降解ZEN的微生物，主要為真菌類和細(xì)菌類。已報(bào)道的真菌類如粉紅粘帚菌、絲孢酵母菌、黑曲霉等都可以降解ZEN，然而由于部分真菌自身會產(chǎn)生毒素或致病，因此真菌直接作為飼料添加劑來解毒受到限制[10-12]。目前發(fā)現(xiàn)的能降解ZEN的細(xì)菌種類也較多，如不動桿菌、短小芽孢桿菌、賴氨酸芽孢桿菌等[12-15]。

本研究擬利用富集馴化的方法，從豬糞便中篩選出一株可以高效降解ZEN的細(xì)菌，通過研究菌株降解特性，優(yōu)化降解條件，并探索其降解機(jī)理，為其在飼料中的脫毒應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

豬糞便樣品采集自河北邢臺南和縣農(nóng)家豬舍，新鮮的糞便樣品分裝到無菌的50 mL離心管中，當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-20 ℃冰箱直至使用。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

甲醇、乙腈均為色譜純級；ZEN標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 6.8～7.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，固體培養(yǎng)基添加1.8%的瓊脂。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(LC-20AT)，熒光檢測器(RF-20A)，超聲波細(xì)胞破碎儀(JY92-IIN)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ZEN的測定方法

樣品中ZEN的濃度測定采用高效液相色譜法(HPLC)測定，色譜柱：安捷倫SB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈/水/甲醇=46∶46∶8；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；熒光檢測器：激發(fā)波長(Ex)=235 nm，發(fā)射波長(Em)=460 nm。

ZEN降解率=(1-降解后培養(yǎng)基中ZEN濃度/空白對照組中ZEN濃度)×100%

1.3.2 ZEN降解菌的篩選

取1.0 g豬糞便樣品于10 mL無菌蒸餾水中，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 h左右，靜置10 min，取上清液100 μL加入到10 mL的LB培養(yǎng)基中(ZEN初始濃度為20 mg/L)，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4 d。按此步驟馴化3次，結(jié)束后取0.2 mL樣品，加入0.6 mL甲醇，渦旋1 min，12 000 r/min離心10 min，將上清液過0.22 μm的尼龍濾膜，HPLC檢測ZEN濃度。最后一次馴化的菌液梯度稀釋涂布LB平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取形態(tài)不同的菌落劃線純化3次。將純化后的單克隆菌落接種到1 mL含10 mg/L的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h，空白對照組不接種菌落，每組3個(gè)重復(fù)。按前述步驟進(jìn)行樣品前處理，HPLC檢測不同菌株對ZEN的降解率，其中ZEN降解率最高的菌株命名為ZJ-2019-1，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.3 ZJ-2019-1菌株的鑒定

形態(tài)鑒定：將獲得的菌株在LB平板劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h觀察菌落形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落顏色等。對菌株進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)特征。

16S rDNA鑒定：將降解活性最高的菌株接種到LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)16 h，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物為細(xì)菌通用引物：16S-27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和16S-1495R (5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)，擴(kuò)增后的產(chǎn)物由檢測公司純化和測序。測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹使用Mega 6.0生物信息學(xué)軟件分析完成。

1.3.4 ZJ-2019-1吸附與降解ZEN的活性驗(yàn)證

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的ZJ-2019-1菌液(3.1×1010cfu/mL)等體積分成兩份，其中一份菌液6 000 r/min離心5 min，棄去上清，用無菌的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，50 mmol/L，pH 7.4)清洗菌體沉淀3次，然后用等體積含10 mg/L ZEN的無菌PBS懸浮。另一份菌液于121 ℃高壓蒸汽滅活20 min，然后按同樣的方法處理。以含ZEN的無菌PBS緩沖溶液為空白對照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，37 ℃，200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h，各取樣1 mL，12 000 r/min離心10 min，檢測上清液中的ZEN的殘留量。離心后的菌體用甲醇浸提30 min后檢測菌體對ZEN的吸附量。

1.3.5 ZJ-2019-1菌株降解ZEN的活性成分定位

將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的ZJ-2019-1菌液(3.4×1010cfu/mL)在8 000 r/min、4 ℃離心20 min，上清液過0.22 μm的Millipore Express PES濾膜，獲得無細(xì)胞上清液，暫存于4 ℃。離心后的菌體沉淀用PBS清洗3次，然后用PBS重懸，重懸后的細(xì)胞置于冰水浴中，采用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，破碎條件：超聲5 s，停5 s，超聲功率600 W，超聲時(shí)間33 min。破碎后的細(xì)胞碎片10 000 r/min，4 ℃離心20 min，上清液過0.22 μm的Millipore Express PES濾膜，獲得細(xì)胞內(nèi)容物。將無細(xì)胞上清液分成五部分，其中一份不做處理，其余四份分別進(jìn)行不同處理：處理組1在100 ℃水浴2 h；處理組2添加1%SDS；處理組3添加蛋白酶K(2 mg/mL, 58 ℃水浴2 h)；處理組4添加蛋白酶K(2 mg/mL, 58 ℃水浴2 h)和1%SDS。將不同處理組各取1 mL，添加10 mg/L ZEN共培養(yǎng)，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)48 h后采用HPLC檢測不同處理組中ZEN的殘留量。

1.3.6 不同因素對ZJ-2019-1菌株降解ZEN的影響

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的ZJ-2019-1菌液6 000 r/min離心5 min，棄去上清，用無菌LB液體培養(yǎng)基清洗細(xì)胞沉淀3次后重懸菌體細(xì)胞，使得菌懸液OD600=0.3～0.5。按照培養(yǎng)溫度(22、27、32、37、42 ℃)、初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)、培養(yǎng)時(shí)間(0、6、12、24、36、48 h)和初始ZEN濃度(2、5、10、20、40 mg/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)基的初始pH采用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。當(dāng)其中一個(gè)因素變化時(shí)，其他因素固定為溫度37 ℃，初始pH 7.0，ZEN濃度10 mg/L和反應(yīng)時(shí)間48 h。接種量均為2%，空白對照組不接種菌液，其他處理與實(shí)驗(yàn)組相同，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。將所有反處理組置于200 r/min的恒溫?fù)u床中，反應(yīng)結(jié)束后取樣，HPLC檢測ZEN的殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的篩選

豬糞便樣品經(jīng)過3次富集馴化后，對ZEN的降解率為94.1%。將富集馴化3次的菌液在LB平板上稀釋涂布，挑取形態(tài)不同的菌落進(jìn)行劃線純化，共獲得10株菌株。將這10株菌株進(jìn)行復(fù)篩，驗(yàn)證其對ZEN的降解效率，復(fù)篩結(jié)果如表1所示。經(jīng)HPLC檢測，其中一株菌株在LB培養(yǎng)基中對ZEN的降解率能達(dá)到98%以上，該菌株命名為ZJ-2019-1。圖1為ZJ-2019-1降解ZEN的HPLC色譜圖，由圖1可看出，當(dāng)ZJ-2019-1和ZEN共培養(yǎng)48 h后，ZEN的峰(6.83 min)明顯降低，與不加入ZEN的對照組相比，產(chǎn)生了新的物質(zhì)峰(2.25 min)，該物質(zhì)可能為ZEN的代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)和毒性有待進(jìn)一步研究。

表1 降解玉米赤霉烯酮菌株的復(fù)篩結(jié)果

圖1 ZJ-2019-1菌株降解ZEN的HPLC圖譜

2.2 ZJ-2019-1菌株的鑒定

ZJ-2019-1在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后的菌落形態(tài)為：菌落為淡黃色，不透明，菌落大小不一，直徑2～8 mm，邊緣不規(guī)則，表面有褶皺；革蘭氏染色為陽性，菌體呈短桿狀。將ZJ-2019-1菌株的16S rDNA基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示ZJ-2019-1菌株與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的16S rDNA序列相似性最高，達(dá)到99.9%。從圖2可以看出，ZJ-2019-1與枯草芽孢桿菌在同一分支上。綜上分析，初步鑒定ZJ-2019-1為枯草芽孢桿菌。一些芽孢桿菌能夠降解ZEN，但是不同菌株對ZEN的降解活性，降解條件差異較大，這可能與菌株種類和生存環(huán)境有關(guān)[16-17]。芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗逆性，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌更是廣泛應(yīng)用于畜產(chǎn)和水產(chǎn)飼料添加劑中，因此，篩選不同益生菌株，并增強(qiáng)其降解ZEN的功能，將具有重要應(yīng)用價(jià)值。

2.3 ZJ-2019-1菌株對ZEN吸附與降解活性驗(yàn)證

將ZJ-2019-1菌株的活細(xì)胞與滅活細(xì)胞與10 mg/L ZEN共培養(yǎng)，檢測ZEN在共培養(yǎng)上清液和菌體細(xì)胞中的含量，判斷菌株對ZEN的清除作用是降解還是吸附。經(jīng)檢測，活細(xì)胞、滅活細(xì)胞、活細(xì)胞上清液和滅活細(xì)胞上清液中的ZEN含量分別為(6.2±2.1)%、(47.3±4.7)%、(16.1±3.6)%和(54.0±3.8)%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，活細(xì)胞反應(yīng)體系中ZEN的清除率均高于滅活細(xì)胞體系，說明除吸附作用外，活細(xì)胞對ZEN還有降解作用。而活細(xì)胞中ZEN含量遠(yuǎn)低于滅活細(xì)胞中ZEN含量，原因可能是加熱滅活過程破壞了細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使得細(xì)胞壁變薄而孔徑增大，從而增強(qiáng)了吸附真菌毒素的能力[17,18]。同時(shí)，活細(xì)胞上清液中的ZEN含量遠(yuǎn)低于滅活細(xì)胞上清液中的ZEN含量，這表明ZJ-2019-1菌株活細(xì)胞對ZEN的清除主要是降解作用。

2.4 ZJ-2019-1菌株降解ZEN的活性成分定位

由圖3可知，ZJ-2019-1的無細(xì)胞上清液對ZEN的降解活性遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)容物，說明降解ZEN的活性物質(zhì)主要存在于胞外。將無細(xì)胞上清液經(jīng)過不同的失活處理后，其對ZEN的降解效率均有不同程度下降。經(jīng)100 ℃水浴或者SDS失活處理后，無細(xì)胞上清液對ZEN的降解率均降低了50%左右，但仍保留了一部分降解活性，說明降解ZEN的活性物質(zhì)對高溫有一定的耐受性。Shu等[19]篩選的一株貝萊斯芽孢桿菌(BacillusvelezensisDY3108)的無細(xì)胞上清液能夠高效降解黃曲霉毒素B1，且上清液經(jīng)過沸水浴或121 ℃高壓蒸汽處理30 min后仍有很高的降解活性，本研究篩選的枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的作用于ZEN的活性物質(zhì)可能與其具有相似的熱穩(wěn)定性。當(dāng)用蛋白酶K處理后，無細(xì)胞上清液對ZEN的降解率下降至24.0%，而用蛋白酶K和SDS共同處理后，降解活性則基本喪失，說明能降解ZEN的胞外活性物質(zhì)能夠被蛋白酶K水解而失活，由此推斷該活性物質(zhì)可能是ZJ-2019-1分泌的胞外酶[20]。

注：處理組1為100 ℃水浴2 h；處理組2為SDS處理；處理組3為蛋白酶K處理；處理組4為蛋白酶K和SDS共同處理。圖3 ZJ-2019-1菌株活細(xì)胞和滅活細(xì)胞對ZEN的去除效果

2.5 不同因素對ZJ-2019-1菌株降解ZEN的影響

圖4顯示了反應(yīng)時(shí)間、溫度、初始pH和ZEN濃度等因素對ZJ-2019-1菌株降解ZEN的影響。從圖4可看出，ZJ-2019-1菌株對ZEN的降解率隨著時(shí)間的增加而增加，在48 h內(nèi)可以將LB培養(yǎng)基中10 mg/L ZEN清除99.7%，且降解速率在24 h后趨于平緩，原因可能是24 h后菌體開始進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)酶活性下降。此外，培養(yǎng)基中底物的濃度減小也會導(dǎo)致降解速率下降[6]。溫度對ZJ-2019-1降解ZEN的效率有較大影響，37 ℃為該菌降解ZEN的最適溫度。當(dāng)溫度低于37 ℃時(shí)，該菌株對ZEN的降解率隨溫度降低而降低。ZJ-2019-1菌株具有廣泛的pH適應(yīng)能力，在初始pH 5.0～9.0時(shí)對ZEN均保持很高的降解活性。在初始pH為4.0時(shí)，ZJ-2019-1對ZEN的降解率明顯降低，初始pH 7.0為ZJ-2019-1降解ZEN的最適pH。ZEN的初始質(zhì)量濃度對降解效果也有影響，當(dāng)ZEN的初始質(zhì)量濃度不超過20 mg/L時(shí)，ZJ-2019-1對ZEN的降解率高于95%，而當(dāng)ZEN的初始質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，ZEN的清除率明顯降低。

圖4 不同因素對ZJ-2019-1菌株降解ZEN的影響

3 結(jié)論

通過富集馴化的方法從豬糞便中分離出一株能夠高效降解ZEN的菌株ZJ-2019-1，通過形態(tài)和16S rDNA分析的方法，初步鑒定為枯草芽孢桿菌。該菌株在LB培養(yǎng)基中48 h內(nèi)能將10 mg/L的ZEN去除99%以上。對降解機(jī)理的研究表明，該菌株可以通過吸附和酶降解共同清除ZEN，其中酶降解為主要作用。該菌株對ZEN的降解活性受反應(yīng)溫度、pH和ZEN濃度的影響，降解反應(yīng)的最適溫度和初始pH分別為37 ℃和7.0。本研究中所獲得的的枯草芽孢桿菌可為霉菌毒素的生物脫毒提供新的研究材料，在本研究基礎(chǔ)上，我們將進(jìn)一步對降解產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和毒性研究，同時(shí)也將對降解酶進(jìn)行分離純化。